ट्रैकिंग Anastasis, apoptosis उलट है कि एक सेल अस्तित्व घटना के लिए रणनीतियाँ
Summary
The term anastasis refers to the phenomenon in which dying cells reverse a cell suicide process at a late stage, repair themselves, and ultimately survive. Here we demonstrate protocols for detecting and tracking cells that undergo anastasis.
Abstract
Anastasis ("जीवन के लिए बढ़ती" के लिए यूनानी) मर कोशिकाओं की वसूली करने के लिए संदर्भित करता है। इन कोशिकाओं को ठीक करने से पहले, वे mitochondrial विखंडन, साइटोसॉल में माइटोकॉन्ड्रियल साइटोक्रोम ग की रिहाई, caspases की सक्रियता, क्रोमेटिन संक्षेपण, डीएनए की क्षति, परमाणु विखंडन, प्लाज्मा झिल्ली blebbing, सेल संकोचन, कोशिका की सतह जोखिम सहित apoptosis की महत्वपूर्ण चौकियों के माध्यम से पारित कर दिया है phosphatidylserine, और apoptotic निकायों के गठन की। Apoptotic उत्तेजनाओं जिससे मर कोशिकाओं apoptosis और संभवतः अन्य मृत्यु तंत्र रिवर्स करने के लिए अनुमति देता है, मौत के लिए पहले हटा रहे हैं जब Anastasis हो सकता है। इसलिए, Anastasis भी अनुपयुक्त क्षतिग्रस्त कोशिकाओं को उठाना पड़ सकता है कि शारीरिक चिकित्सा प्रक्रियाओं को शामिल करने के लिए प्रकट होता है। कार्यों और Anastasis के तंत्र को जाहिरा तौर पर स्वस्थ कोशिकाओं की वसूली के बाद अतीत की घटनाओं का पता लगाने के लिए सीमित साधनों के हिस्से में बाधा, अभी स्पष्ट नहीं कर रहे हैं। रणनीतियाँ Anasta पता लगाने के लिएबहन Anastasis मिलाना शारीरिक तंत्र का अध्ययन, रोग विकृति में मरे कोशिकाओं के खतरों, और संभावित चिकित्सा विज्ञान में सक्षम होगा। यहाँ, हम जीवित कोशिका माइक्रोस्कोपी और स्तनधारी कोशिकाओं में Anastasis की पहचान करने और ट्रैकिंग के लिए एक स्तनधारी कस्पासे biosensor का उपयोग करते हुए प्रभावी रणनीति का वर्णन है।
Introduction
Apoptosis ("मौत के लिए गिरने" के लिए यूनानी) आम तौर पर सेल आत्महत्या 1-7 में समाप्त होने वाले एक तरह से इस प्रक्रिया को माना जाता है। पहले से ही apoptosis के मार्ग 8,9 शुरू की है कि कोशिकाओं सहित अन्यथा पूरे पशुओं में मर जाएगा कि अतिरिक्त कोशिकाओं, के अस्तित्व में समर्थक मौत जीन परिणामों की जेनेटिक विघटन। इसी तरह, आनुवंशिक जोड़तोड़ कृत्रिम रूप से प्रदर्शित संकेतों "मुझे खाना" या कि उनके बाह्य मैट्रिक्स के लिए चिपचिपाहट खोना कि स्वस्थ स्तनधारी कोशिकाओं पूरे सेल phagocytosis या entosis क्रमश: 10,11 से मौत से बचने के लिए अनुमति देते हैं। हालांकि, हम और दूसरों को भी apoptosis को 12-15 के प्रारंभिक दौर से ठीक हो सकता है आनुवंशिक हेरफेर सामान्य स्वस्थ स्तनधारी कोशिकाओं और सेल लाइनों के बिना दिखाया है। कोशिकाओं ठेठ कि महत्वपूर्ण चौकियों पारित कर दिया है के बाद व्यक्ति की कोशिकाओं को ट्रैक करने के लिए उपकरण का उपयोग करना, हम आगे, apoptosis के 12,13 की देर चरणों से वसूली का प्रदर्शन किया हैly के 2-6 "नहीं लौटने की बात" मार्क। देर चरण apoptosis के इन चौकियों माइटोकॉन्ड्रियल साइटोक्रोम ग की रिहाई, caspases की सक्रियता, परमाणु विखंडन, और apoptotic निकायों के गठन शामिल है। हम कोशिका मृत्यु 2-6 की कगार पर apoptosis के इस उत्क्रमण का वर्णन करने के लिए, "जीवन के लिए बढ़ती" जिसका अर्थ है एक ग्रीक यौगिक शब्द "Anastasis," अपनाया।
पूरे मर-वसूली की प्रक्रिया लाइव सेल इमेजिंग द्वारा मनाया जाता है, जब तक कि यह apoptotic घटनाओं का अनुभव नहीं है कि कोशिकाओं से Anastasis आया है कि कोशिकाओं को अलग करने के लिए चुनौती दे रहा है। काम के दशकों apoptosis के द्वारा सेल आत्महत्या की रूपात्मक सुविधाओं evolutionarily संरक्षित जैव रासायनिक और आणविक घटनाओं 16-19 से संचालित कर रहे हैं कि पता चला है। इन घटनाओं के क्षतिग्रस्त या डी को नष्ट करने से कोशिकीय और बहुकोशिकीय जीवों में विकास और homoeostatic प्रक्रियाओं को विनियमित करने के लिए कोशिकाओं की आत्म-विनाश को बढ़ावा देने केangerous कोशिकाओं 16-19। Apoptotic कोशिकाओं आसानी से apoptosis के 1,5,6,16,20 के मानकीकृत, रूपात्मक जैव रासायनिक और आणविक अभिव्यक्तियों से प्रतिष्ठित किया जा सकता है, जबकि वर्तमान में Anastasis 12,13 के लिए विशिष्ट कोई ज्ञात मार्कर है। महत्वपूर्ण बात है, Anastasis आया है कि कोशिकाओं के सामान्य स्वस्थ कोशिकाओं, और सिर्फ apoptosis के पीछे शुरू कि कोशिकाओं के रूप में प्रकट apoptotic मर कोशिकाओं 12,13 होना दिखाई देते हैं। इस प्रकार, नए उपकरणों के लिए एक दिया जीवित सेल पहले से सक्रिय apoptotic प्रक्रियाओं का अनुभव था कि निश्चितता के साथ समाप्त करने के लिए आवश्यक हैं।
यह एक तेजी से और बड़े पैमाने पर विनाश की प्रक्रिया है क्योंकि apoptosis आम तौर पर एक अपरिवर्तनीय झरना के रूप में माना जाता है। माइटोकॉन्ड्रिया ऐसे साइटोसॉल 21,22 में साइटोक्रोम ग के रूप में apoptogenic कारकों जारी किया है एक बार कुछ कोशिकाओं, apoptosis को आरंभ करने के लिए के लिए यह दिन मिनट लग सकता है, caspases, 5 मिनट 23,24 के भीतर सक्रिय साइटोप्लास्मिक द्वारा पीछा किया जा सकता है औरपरमाणु 10 मिनट 25-27 भीतर संक्षेपण, और कोशिका मृत्यु उसके बाद शीघ्र ही 25-27। सक्रिय caspases cleaving और ऐसे endonuclease अवरोध करनेवाला DFF45 / ICAD 29,30 के रूप में सेलुलर विध्वंस 2,28, के प्रयोजन के लिए महत्वपूर्ण संरचनात्मक और कार्यात्मक घटकों को निष्क्रिय द्वारा apoptosis के आर्केस्ट्रा। Caspases भी ऐसी 31,32 सी साइटोक्रोम की माइटोकॉन्ड्रियल रिहाई को बढ़ावा देने के माइटोकॉन्ड्रिया के लिए translocates जो बीसीएल -2 परिवार के सदस्य बोली, के रूप में समर्थक apoptotic कारकों को सक्रिय करें। कस्पासे गतिविधि भी phagocytosis 33 के माध्यम से मैक्रोफेज या पड़ोसी कोशिकाओं द्वारा कोशिकाओं को मरने का घिराव को बढ़ावा देने के लिए एक "मुझे खाना" संकेत के रूप में phosphatidylserine की कोशिका की सतह जोखिम में यह परिणाम है। इसके अलावा, apoptotic घटनाओं सेलुलर बायोइनरजेटिक्स और चयापचय 34,35,36 में खलल न डालें बेकार माइटोकॉन्ड्रिया, प्रस्तुत करना। इस प्रकार, इस तरह के विनाश से वसूली में intuitively संभावना नहीं लगती।
मूल के विपरीत उम्मीदations, कोशिकाओं को भी एक अंतिम चरण में apoptotic कोशिका मृत्यु की प्रक्रिया को उल्टा कर सकते हैं। लगातार संस्कृति में कोशिकाओं के मरने का भाग्य निगरानी करके, हम प्राथमिक कोशिकाओं और सेल लाइनों 12,13 की एक श्रेणी में देर चरण apoptosis के उलटने मनाया। मौत प्रोत्साहन का हटाया जाना, ऐसे mitochondrial विखंडन, क्रोमेटिन संक्षेपण, डीएनए की क्षति, प्लाज्मा झिल्ली blebbing, phosphatidylserine की कोशिका की सतह जोखिम, माइटोकॉन्ड्रियल साइटोक्रोम ग की रिहाई, कस्पासे सक्रियण, परमाणु विखंडन, सेल संकोचन के रूप में apoptosis के प्रकट सुविधाओं से वसूली की अनुमति दी apoptotic निकायों का और गठन। इन टिप्पणियों Anastasis के कार्यों, परिणाम, और तंत्र के बारे में अनुत्तरित सवाल उठा। इन सवालों को संबोधित करने के लिए, एक शर्त मज़बूती Anastasis आया है कि कोशिकाओं की पहचान है। यहाँ, हम रहते माइक्रोस्कोपी तरीकों और पहले से देर चरण apoptosis और वें उलट है कि कोशिकाओं का पता लगाने के लिए एक कस्पासे biosensor का वर्णनएन बच गई।
Protocol
Representative Results
Discussion
Anastasis कोशिका मृत्यु मार्ग सक्रिय कर लिया है कि कोशिकाओं बाद मरने की प्रक्रिया रिवर्स और जीवित रहते हैं जहां घटना को दर्शाता है। यहाँ, हम जीना सेल इमेजिंग वास्तव में एक ही व्यक्ति की कोशिकाओं एक देर चरण म?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम शब्द "Anastasis" apoptosis के उत्क्रमण का वर्णन करने के सुझाव के लिए रेव डॉ राल्फ Bohlmann और रेव डॉ जेम्स Voelz धन्यवाद; Stably साइटोक्रोम ग -GFP व्यक्त हेला कोशिकाओं के लिए डगलस आर ग्रीन; H446 कोशिकाओं के लिए चार्ल्स एम रूडिन और एरिक ई गार्डनर; वीडियो पर कार्टून ड्राइंग में सहायता के लिए हीथ मेमने; इस पांडुलिपि की बहुमूल्य चर्चा के लिए यी हुई यीओ। यह काम एक सर एडवर्ड Youde मेमोरियल फैलोशिप (HLT), डॉ वाल्टर Szeto मेमोरियल छात्रवृत्ति (HLT), फुलब्राइट अनुदान 007-2009 (HLT), लाइफ साइंस रिसर्च फाउंडेशन फैलोशिप (HLT) द्वारा समर्थित किया गया था, एनआईएच NS037402 (JMH) अनुदान और NS083373 (JMH), और हांगकांग विश्वविद्यालय अनुदान समिति AoE / बी-07/99 (एमसीएफ)। हो लाम तांग लाइफ साइंसेज रिसर्च फाउंडेशन की एक Shurl और Kay CURCI फाउंडेशन फैलो हैं।
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| LSM780 confocal microscopy | Carl Zeiss | / | |
| Glass bottom culture dish | MatTek Corporation | P35G-0-14-C | |
| Transparent CultFoi | Carl Zeiss | 000000-1116-084 | |
| CO2 independent medium | Life Technologies | 18045-088 | |
| CellTracker | Life Technologies | C34552 | |
| Mitotracker Red CMXRos | Life Technologies | M-7512 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H1399 | |
| Fluorescently labeled annexin V | Biovision | K201 |
References
- Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. British Journal of Cancer. 26, 239-257 (1972).
- Riedl, S. J., Shi, Y. Molecular mechanisms of caspase regulation during apoptosis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5, 897-907 (2004).
- Green, D. R., Kroemer, G. The pathophysiology of mitochondrial cell death. Science. 305, 626-629 (2004).
- Chipuk, J. E., Bouchier-Hayes, L., Green, D. R. Mitochondrial outer membrane permeabilization during apoptosis: the innocent bystander scenario. Cell Death and Differentiation. 13, 1396-1402 (2006).
- Kroemer, G., et al. Classification of cell death recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2009. Cell Death and Differentiation. 16, 3-11 (2009).
- Galluzzi, L., et al. Molecular definitions of cell death subroutines: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2012. Cell Death and Differentiation. 19, 107-120 (2012).
- Holland, A. J., Cleveland, D. W. Chromoanagenesis and cancer: mechanisms and consequences of localized, complex chromosomal rearrangements. Nature Medicine. 18, 1630-1638 (2012).
- Reddien, P. W., Cameron, S., Horvitz, H. R. Phagocytosis promotes programmed cell death in C. elegans. Nature. 412, (2001).
- Hoeppner, D. J., Hengartner, M. O., Schnabel, R. Engulfment genes cooperate with ced-3 to promote cell death in Caenorhabditis elegans. Nature. 412, 202-206 (2001).
- Segawa, K., et al. Caspase-mediated cleavage of phospholipid flippase for apoptotic phosphatidylserine exposure. Science. 344, 1164-1168 (2014).
- Overholtzer, M., et al. A nonapoptotic cell death process, entosis, that occurs by cell-in-cell invasion. Cell. 131, 966-979 (2007).
- Tang, H. L., Yuen, K. L., Tang, H. M., Fung, M. C. Reversibility of apoptosis in cancer cells. British Journal of Cancer. 100, (2009).
- Tang, H. L., et al. Cell survival, DNA damage, and oncogenic transformation after a transient and reversible apoptotic response. Molecular Biology of the Cell. 23, 2240-2252 (2012).
- Hammill, A. K., Uhr, J. W., Scheuermann, R. H. Annexin V staining due to loss of membrane asymmetry can be reversible and precede commitment to apoptotic death. Experimental Cell Research. 251, (1999).
- Geske, F. J., Lieberman, R., Strange, R., Gerschenson, L. E. Early stages of p53-induced apoptosis are reversible. Cell Death and Differentiation. 8, 182-191 (2001).
- Jacobson, M. D., Weil, M., Raff, M. C. Programmed cell death in animal development. Cell. 88, 347-354 (1997).
- Hardwick, J. M., Cheng, W. C. Mitochondrial programmed cell death pathways in yeast. Developmental Cell. 7, 630-632 (2004).
- Frohlich, K. U., Fussi, H., Ruckenstuhl, C. Yeast apoptosis-from genes to pathways. Seminars in Cancer Biology. 17, 112-121 (2007).
- Fuchs, Y., Steller, H. Programmed cell death in animal development and disease. Cell. 147, 742-758 (2011).
- Taylor, R. C., Cullen, S. P., Martin, S. J. Apoptosis: controlled demolition at the cellular level. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9, 231-241 (2008).
- Wang, X. The expanding role of mitochondria in apoptosis. Genes & Development. 15, 2922-2933 (2001).
- Galluzzi, L., Kepp, O., Kroemer, G. Mitochondria: master regulators of danger signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biolog. 13, 780-788 (2012).
- Goldstein, J. C., Waterhouse, N. J., Juin, P., Evan, G. I., Green, D. R. The coordinate release of cytochrome c during apoptosis is rapid, complete and kinetically invariant. Nature Cell Biology. 2, 156-162 (2000).
- Goldstein, J. C., et al. Cytochrome c is released in a single step during apoptosis. Cell Death and Differentiation. 12, 453-462 (2005).
- Tyas, L., Brophy, V. A., Pope, A., Rivett, A. J., Tavare, J. M. Rapid caspase-3 activation during apoptosis revealed using fluorescence-resonance energy transfer. EMBO Reports. 1, 266-270 (2000).
- Takemoto, K., Nagai, T., Miyawaki, A., Miura, M. Spatio-temporal activation of caspase revealed by indicator that is insensitive to environmental effects. The Journal of Cell Biology. 160, 235-243 (2003).
- Albeck, J. G., et al. Quantitative analysis of pathways controlling extrinsic apoptosis in single cells. Molecular Cell. 30, 11-25 (2008).
- Luthi, A. U., Martin, S. J. The CASBAH: a searchable database of caspase substrates. Cell Death and Differentiation. 14, 641-650 (2007).
- Liu, X., Zou, H., Slaughter, C., Wang, X. DFF, a heterodimeric protein that functions downstream of caspase-3 to trigger DNA fragmentation during apoptosis. Cell. 89, 175-184 (1997).
- Enari, M., et al. A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD. Nature. 391, 43-50 (1998).
- Li, H., Zhu, H., Xu, C. J., Yuan, J. Cleavage of BID by caspase 8 mediates the mitochondrial damage in the Fas pathway of apoptosis. Cell. 94, 491-501 (1998).
- Slee, E. A., Keogh, S. A., Martin, S. J. Cleavage of BID during cytotoxic drug and UV radiation-induced apoptosis occurs downstream of the point of Bcl-2 action and is catalysed by caspase-3: a potential feedback loop for amplification of apoptosis-associated mitochondrial cytochrome c release. Cell Death and Differentiation. 7, 556-565 (2000).
- Suzuki, J., Denning, D. P., Imanishi, E., Horvitz, H. R., Nagata, S. Xk-related protein 8 and CED-8 promote phosphatidylserine exposure in apoptotic cells. Science. 341, 403-406 (2013).
- Kroemer, G., Martin, S. J. Caspase-independent cell death. Nature Medicine. 11, 725-730 (2005).
- Chipuk, J. E., Green, D. R. Do inducers of apoptosis trigger caspase-independent cell death. Nature Reviews Molecular Cell Biolog. 6, 268-275 (2005).
- Tait, S. W., Green, D. R. Mitochondria and cell death: outer membrane permeabilization and beyond. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 621-632 (2010).
- Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 2979-2984 (1998).
- Zhang, G., Gurtu, V., Kain, S. R., Yan, G. Early detection of apoptosis using a fluorescent conjugate of annexin V. BioTechniques. 23, 525-531 (1997).
- Fenech, M. Cytokinesis-block micronucleus cytome assay. Nature Protocols. 2, 1084-1104 (2007).
- Fenech, M., et al. Molecular mechanisms of micronucleus, nucleoplasmic bridge and nuclear bud formation in mammalian and human cells. Mutagenesis. 26, 125-132 (2011).
- Gordon, D. J., Resio, B., Pellman, D. Causes and consequences of aneuploidy in cancer. Nature Reviews Genetics. 13, (2012).
- Poreba, M., Strozyk, A., Salvesen, G. S., Drag, M. Caspase substrates and inhibitors. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5, a008680 (2013).
- Talanian, R. V., et al. Substrate specificities of caspase family proteases. The Journal of Biological Chemistry. 272, 9677-9682 (1997).
- Logue, S. E., Elgendy, M., Martin, S. J. Expression, purification and use of recombinant annexin V for the detection of apoptotic cells. Nature Protocols. 4, 1383-1395 (2009).
- Kenis, H., et al. Annexin A5 uptake in ischemic myocardium: demonstration of reversible phosphatidylserine externalization and feasibility of radionuclide imaging. Journal of Nuclear Medicine. 51, 259-267 (2010).
- Ruegg, U. T., Staurosporine Burgess, G. M. K-252 and UCN-01: potent but nonspecific inhibitors of protein kinases. Trends in Pharmacological Sciences. 10, 218-220 (1989).
- Bertrand, R., Solary, E., O’Connor, P., Kohn, K. W., Pommier, Y. Induction of a common pathway of apoptosis by staurosporine. Experimental Cell Research. 211, 314-321 (1994).
- Chae, H. J., et al. Molecular mechanism of staurosporine-induced apoptosis in osteoblasts. Pharmacological Research. 42, 373-381 (2000).
- Takemoto, K., et al. Local initiation of caspase activation in Drosophila salivary gland programmed cell death in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13367-13372 (2007).
- Bardet, P. L., et al. A fluorescent reporter of caspase activity for live imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 13901-13905 (2008).
- Florentin, A., Arama, E. Caspase levels and execution efficiencies determine the apoptotic potential of the cell. The Journal of Cell Biology. 196, 513-527 (2012).
- Chihara, T., et al. Caspase inhibition in select olfactory neurons restores innate attraction behavior in aged Drosophila. PLoS Genetics. 10, e1004437 (2014).
