الاستفادة من تصميم مخصص انجذاب غلفاني غرف لدراسة الاتجاه الهجرة من خلايا البروستاتا

Summary

We present a method to apply a physiological electric field to migrating, immortalized prostate cells in a custom-made galvanotaxis chamber. Using this method, we demonstrate that 2 lines of non-tumorigenic prostate cells demonstrate different degrees of migration directionality in the field.

Abstract

يخدم الحقل الكهربائي الفسيولوجية الوظائف البيولوجية محددة، مثل توجيه الهجرة خلية في تطور الجنين، ثمرة العصبية الظهارية والتئام الجروح. تطبيق حقل كهربائي الحالي مباشرة إلى الخلايا المستزرعة في المختبر يدفع الهجرة الخلية الاتجاه، أو انجذاب غلفاني. طريقة انجذاب غلفاني 2-الأبعاد نظهر هنا يتم تعديل مع العرف بولي (كلوريد الفينيل) (PVC) الكاميرات، سطح الزجاج، وأقطاب البلاتين واستخدام مرحلة الآلية التي يتم تصوير الخلايا. غرف PVC وأقطاب البلاتين يحمل منخفضة السمية الخلوية وبأسعار معقولة وقابل لاعادة الاستخدام. سطح الزجاج والمسرح المجهر الآلية تحسين جودة الصور وتسمح التعديلات المحتملة على سطح الزجاج والعلاجات للخلايا. نحن بتصوير انجذاب غلفاني اثنين من غير مكون للأورام، خطوط خلد SV40 خلية البروستاتا، pRNS-1-1 وPNT2. هذه خطوط الخلايا اثنين تظهر بسرعة هجرة مماثلة وكلا تهاجر نحوالكاثود، لكنها تظهر درجة مختلفة من اتجاهها في انجذاب غلفاني. النتائج التي تم الحصول عليها عن طريق هذا البروتوكول تشير إلى أن pRNS-1-1 وخطوط الخلايا PNT2 قد يكون لها سمات مختلفة الجوهرية التي تحكم ردود المهاجرة الاتجاه بهم.

Introduction

تم الكشف عن الحقول الكهربائية المحلية في الأنسجة المختلفة، مثل الجلد ^{1، 32، 33} و الدماغ ^2. يخدم الحقل الكهربائي الفسيولوجية الوظائف البيولوجية محددة، بما في ذلك توجيه تطور الجنين ^{3، 4،} توجيه ثمرة من العمليات العصبية ⁵ و ⁶ و تعزيز الظهارية والقرنية الجرح إغلاق ^{1 و 7.} في المختبر، وتطبيق حقل كهربائي الحالي مباشرة إلى الخلايا المستزرعة يقلد الحقل الكهربائي الفسيولوجية ويستحث الهجرة الخلية الاتجاه، أو انجذاب غلفاني. وقد درست انجذاب غلفاني في الخلايا الليفية ^{8، 9} الكيراتينية الأسماك، الظهارية البشري والخلايا الكيراتينية القرنية ^10-12، الخلايا اللمفية ^13، neuroblasts ^2، والخلايا العصبية السلف ^14. عندما تتعرض لمجال التطبيقية، والغالبية العظمى من الخلايا درس تهاجر إتجاهي نحو المهبطي (-) قطب. ومع ذلك، وعدة خلايا السرطان، بما في ذلك درجة عالية من النقيليخلايا سرطان الثدي البشرية والبروستاتا البشرية خط الخلايا السرطانية PC-3M، الانتقال إلى مصعدي (+) قطب ^{15 و 16.} واقترحت عدة آليات للتوسط انجذاب غلفاني أو لتفسير قدرة الخلايا على الإحساس الحقل الكهربائي، بما في ذلك تفعيل من EGF مستقبلات ^12، قناة الصوديوم الظهارية ^17، PI3K وPTEN ^18، وإطلاق الكالسيوم أيونات ^{15 و 19.} هذه الآلية ليست مفهومة تماما حتى الآن وأنه من الممكن أن تشارك مسارات إشارات متعددة في انجذاب غلفاني.

طريقة انجذاب غلفاني 2-الأبعاد نظهر هنا هو مفيد لتوصيف الهجرة الاتجاه من تمسكا، وخلايا متحركة، إما لمراقبة الهجرة الفردية خلية ^{10، 12، 17} أو الهجرة من ورقة من خلايا متكدسة ^{18 و 20.} يتم تعديل هذه التقنية من بنغ وجافي ^21، ونيشيمورا وآخرون. ¹⁰ مع حسب الطلب، غرف PVC واضحة، مع coversl قابلة للإزالةIPS يسمح لسهولة استرجاعها الخلية بعد انجذاب غلفاني للتحليل الثانوي، مثل التصوير المناعية مضان. السطح الزجاجي للغرف انجذاب غلفاني هو بصري متوافق، مما يسمح للتصوير في تضخم عالية ومع الخلايا fluorescently المسمى. كما يسمح التصميم التجريبي مع تعديل سطح الزجاج، مثل تغيير طلاء السطح أو رسوم. وتستخدم الفواصل مصنوعة من رقم 1 ساترة في غرف للحد من تدفق التيار فوق الخلايا. وبالتالي فإن التدفئة الجول، التي تتناسب مع مربع تدفق التيار، وليس من شأنه أن ارتفاع درجة حرارة الخلايا أثناء التجربة. الجسور أجار ربط تمنع الاتصال المباشر من الأقطاب الكهربائية مع الخلايا وتمنع تغيير درجة الحموضة متوسطة أو تركيز أيون خلال انجذاب غلفاني.

تم فحص اثنين من غير مكون للأورام البروستاتا خطوط الخلايا البشرية للاستجابة انجذاب غلفاني في هذه الدراسة. وpRNS-1-1 ²² و ²³ PNT2 كلاهما SV40 خلد، خطوط الخلايا التي تعتمد على عامل النمو معربا عن علامات الظهارية cytokeratin 5 و 8 و 18 و 19 مع التعبير منخفضة أو معدومة في البروستاتا محددة مستضد (PSA). كل من خطوط الخلايا تحافظ على مورفولوجيا المضلع من الخلايا الظهارية العادية، ولكن لوحظ اضطراب صبغي في تنميط نووي ^{22 و 24.} وعلى الرغم من pRNS-1-1 وPNT2 مشاركة سلوكيات مماثلة في معظم التجارب، إلا أنها تظهر الاختلافات في تشكيل هيكل عنيبية و انجذاب غلفاني. على مصفوفة 3-D، Matrigel، وpRNS-1-1 الخلايا تشكل هياكل جوفاء عنيبية مع شمعة تشبه البروستاتا العادية الغدة الأنسجة ^25. ومع ذلك، فإن الخلايا PNT2 تشكل الأجسام الشبه الكروية الصلبة دون التجويف أو ظهارة الاستقطاب ^26. كما تظهر الخلايا pRNS-1-1 استجابة galvanotactic أعلى من PNT2 في الدراسة الحالية. العلاقة بين تشكيل هيكل عنيبية وانجذاب غلفاني في pRNS-1-1 تشير إلى أن إشارات galvanotactic قد تلعب دورا في تنظيم العلاقات العامةostate الحركات الأنسجة الغدة ردا على الحقول الكهربائية الذاتية، ويوفر المزيد من الخصائص للتمييز بين هذه خطوط الخلايا 2.

Protocol

1. خلايا التثقيف البروستاتا ثقافة pRNS-1-1 وPNT2 البروستاتا الخلايا على 100 ​​أطباق ثقافة ملم في المتوسط ​​1640 RPMI تستكمل مع 10٪ FBS والمضادات الحيوية-مضاد فطري عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2. تحديث مستنبت كل يوم حتى تصل إلى خلا?…

Representative Results

وقد تم التحقيق سطرين من خلايا البروستاتا (pRNS-1-1 وPNT2) مع هذا الأسلوب. خلايا في كل خطوط تهاجر بسرعة مماثلة من 1.0 +/- 0.3 ميكرون / دقيقة على مدار 2 ساعة (الشكل 5A). ومع ذلك، يكون الاتجاه إلى المجال الكهربائي هو 0.7 +/- 0.3 لpRNS-1-1 الخط، و 0.2 +/- 0.8 للخط PNT2 (الشكل 5B). تظهر ال?…

Discussion

وقد تم تحليل استجابة انجذاب غلفاني الخلية مؤشرا وظيفي مهم لكثير من المهاجرة الخلوية أو نمو عمليات ^{27، 28،} وهنا نستخدم غرفة مصنوعة خصيصا مع سطح الزجاج لتصوير اثنين من خطوط الخلايا البروستاتا. هذه خطوط الخلايا أظهرت درجات مختلفة من انجذاب غلفاني، ونحن التكهن بأن ت…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Cells
pRNS-1-1 prostate cells			Lee et. al., (1994)
PNT2 prostate cells	Sigma-Aldrich	95012613-1VL	Berthon et al., (1995)
Medium and solutions
RPMI 1640 medium	Invitrogen	11875-093	warm up to 37°C before use
Fetal Bovine Serum – Premium	Atlanta Biologicals	S11150	10% in PBS, warm up to 37°C before use
Antibiotic-Antimycotic (100x)	Life Technologies	15240	add 5mL to 500mL medium
2-propanol	VWR	BDH1133-5GL
PBS	–	–	137mM NaCl, 2.7mM KCl, 4.3mM Na2HPO4 and 1.5mM KH2PO4 in 1000mL of H2O, pH to 7.4 and autoclaved, warm up to 37°C before use
0.25% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200-056	warm up to 37°C before use, treat cells for 3-5 min at 37°C
Galvanotaxis device
Galvanotaxis chambers	Precision Plastics Inc, CA		custom-designed (1/4" X 2" X 3.5"), non-toxic, clear PVC chambers
Galvanotaxis electrodes	UCD electric shop		platinum coiled electrodes with flexable cords
Galvanotaxis power box	Substrate Engineering, CA		custom-designed DC power output with voltmeter
Microscope Cover Glass, Large, 45X50mm-No. 1.5	Fisher	12-544-F
Microscope Cover Glass, small, 25X25mm, No. 1	ThermoScientific	3307
Diamond point marker	ThermoScientific	750
Marine grade silicon sealer, clear	3M	051135-08019
High vacuum grease	Dow Corning	2021846-0807
6mL syringe	Fisher Scientific	05-561-64
Nichiryo Syringe, 1.5mL	Nichiryo	SG-M
Cotton applicators	Purtian Medical Products	806-WC
Qtips	Johnson & Johnson	729389
Nalgene 180 PVC tubing	Nalgene	8000-9030	503/16 ID x 5/16 OD x 1/16 Wall
Bacto-Agar	Difco	0140-01	make 2% agar solution
Razor Blade	Personna	74-0001
Equipments and Software
Benchtop Centrifuge	Eppendorf	5810R	operated with an A-4-62 rotor
Cellometer Auto T4	Nexcelom	Auto T4
Cellometer counting chambers	Nexcelom	CHT4-SD100-002	load 20uL cell solutions to count
Culture Temp Warming plate	Bel-Art Scienceware	370150000	to keep the galvanotaxis chambers at 37°C
Eclipse TE-2000 microscope with motorized stage and environmental chamber	Nikon
Plan Fluor 10X/0.30 objective len	Nikon
Retiga EX CCD camera	Qimaging		Cooled CCD camara, mono-color, 12-bit
Compressed air with 5% CO2	Airgas		special order
Volocity 6.3	PerkinElmer		Image acquiring software
Improvision OpenLab 5.5.2	PerkinElmer		Cell tracking software and customized to measure migration angles
FileMaker Pro Advanced, 8.0	FileMaker
Microsoft Excel 2008 for Mac	Microsoft