Utilizando a pedido de clientes Galvanotaxis Chambers para Estudar Direcional migração das células da próstata

Summary

We present a method to apply a physiological electric field to migrating, immortalized prostate cells in a custom-made galvanotaxis chamber. Using this method, we demonstrate that 2 lines of non-tumorigenic prostate cells demonstrate different degrees of migration directionality in the field.

Abstract

O campo eléctrico fisiológico serve funções biológicas específicas, tais como dirigir a migração de células no desenvolvimento embrionário, crescimento neuronal e reparação epitelial. A aplicação de um campo eléctrico de corrente directa para células cultivadas in vitro, induz a migração de células direccional, ou galvanotaxis. O método galvanotaxis 2-dimensional demonstramos aqui é modificado com feito por encomenda poli (cloreto de vinilo) (PVC) câmaras, superfície de vidro, eléctrodos de platina e a utilização de uma fase motorizada no qual as células são criadas imagens. As câmaras de PVC e eletrodos de platina apresentam baixa toxicidade e são acessíveis e re-utilizável. A superfície de vidro e a platina motorizada microscópio melhorar a qualidade das imagens e permitir a possibilidade de alterar a superfície do vidro e tratamentos para as células. Filmamos o galvanotaxis de dois, linhas de células não-tumorais imortalizada com SV40 próstata, PRN-1-1 e PNT2. Estas duas linhas de células mostram velocidades de migração semelhantes e ambos migrar em direcçãocátodo, mas mostram um grau diferente de direcionalidade em galvanotaxis. Os resultados obtidos através deste protocolo sugerem que os PRN-1-1 e as linhas de células PNT2 podem ter diferentes características intrínsecas que governam as suas respostas migratórias direcionais.

Introduction

Campos eléctricos endógenos são detectados em vários tecidos, tais como ^{pele, 1, 32, 33} e ² cérebro. O campo eléctrico fisiológico serve funções biológicas particulares, incluindo a orientação desenvolvimento embrionário ^{3, 4,} guiando o crescimento de processos neuronais ^{5, 6} e promoção do epitélio da córnea e o fechamento da ferida ^{1, 7.} In vitro, a aplicação de um campo eléctrico de corrente directa para células cultivadas imita o campo elétrico fisiológico e induz a migração de células direcional, ou galvanotaxis. Galvanotaxis foi estudado em fibroblastos ^8, queratinócitos de peixe ^9, epitelial da córnea humana e queratinócitos ^{10-12, 13} linfócitos, ^2, neuroblastos e as células progenitoras neuronais ^14. Quando exposta ao campo aplicado, a maioria das células estudadas migrar direccionalmente para a catódica (-) pólo. No entanto, várias células cancerosas, incluindo altamente metastáticocélulas de cancro da mama humano e a linha de células de cancro da próstata humano PC-3M, mover-se para a anódica (+) pólo ^{15, 16.} Vários mecanismos são propostos para mediar galvanotaxis ou para explicar a capacidade das células para detectar o campo eléctrico, incluindo a activação de receptores EGF ^12, o canal de sódio epitelial ^17, PI3K e PTEN ^18, e liberação de íons cálcio ^{15, 19.} O mecanismo ainda não é totalmente compreendido, e é possível que múltiplas vias de sinalização estão envolvidos em galvanotaxis.

O método galvanotaxis 2-dimensional demonstramos aqui é útil para caracterizar a migração direccional de aderente, células móveis, quer para controlar a migração de células individuais ^{10, 12, 17} ou migração de uma folha de células confluentes ^{18, 20.} Esta técnica é uma modificação Peng e Jaffe ^21, e Nishimura et al. ¹⁰ com câmaras de PVC feito por encomenda, claras, com coversl removívelips permitindo a recuperação de células fácil depois galvanotaxis para análise secundária, como a imagem de imuno-fluorescência. A superfície de vidro dos câmaras galvanotaxis óptico é compatível, o que permite que a película de alta ampliação e com células fluorescentemente marcado. Ele também permite que o desenho experimental com a modificação da superfície de vidro, como a alteração do revestimento de superfície ou encargos. Espaçadores feitos de uma lamela No. são usados ​​nas câmaras para minimizar o fluxo de corrente sobre as células; Por conseguinte, o aquecimento por efeito de Joule, o que é proporcional ao quadrado da intensidade da corrente, não sobreaquecer as células durante a experiência. As pontes que ligam agar evitar o contato direto dos eletrodos com as células e evitar a mudança do meio de pH ou concentração de íons durante galvanotaxis.

Duas linhas de células de próstata humana não tumorigénicas foram examinadas quanto à sua resposta galvanotaxis neste estudo. Os PRN-1-1 ²² e PNT2 ²³ são ambos SV40-imortalizada, de crescimento de linhas celulares dependentes de factores expressando os marcadores epiteliais citoqueratina 5, 8, 18 e 19 com pouca ou nenhuma expressão do antigénio específico da próstata (PSA). Ambas as linhas celulares manter a morfologia poligonal de células epiteliais normais, mas cromossoma anormalidade foi observada no cariótipo ^{22, 24.} Embora PRN-1-1 e PNT2 partes comportamentos semelhantes na maior parte das experiências, eles mostram diferenças na formação de estrutura e nos ácinos galvanotaxis. Em uma matriz 3-D, Matrigel, os PRN-1-1 células formam estruturas acinares ocas com lumens que assemelham-se a próstata normal de tecido glandular ^25. No entanto, as células PNT2 formar esferóides sólidos sem um lúmen ou epitélio polarizado ^26. As células PRN-1-1 também demonstram uma resposta mais elevada do que a galvanotactic PNT2 no estudo corrente. A correlação entre a formação de estrutura e acinar galvanotaxis em PRN-1-1 sugere que os sinais galvanotactic pode desempenhar um papel na organização do prmovimentos dos tecidos glandulares ostate em resposta a campos elétricos endógenos, e fornece mais características de discriminar entre estes 2 linhas celulares.

Protocol

1. A cultura da próstata Células Cultura A PRN-1-1 e PNT2 próstata células em placas de 100 mm de cultura em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de FBS e Antibiótico-antimicótico a 37 ° C com 5% de CO 2. Refrescar o meio de cultura todos os dias até as células atingirem a confluência de 80% para as experiências galvanotaxis. 2. Montagem Galvanotaxis Chambers Montagem câmaras inferiores Wipe uma câmara galvanotaxis plástico com 2-p…

Representative Results

Duas linhas de células da próstata (PRN-1-1 e PNT2) foram investigadas com este método. As células em ambas as linhas de migrar a velocidades similares de 1,0 +/- 0,3 micra / min ao longo de 2 horas (Figura 5A). No entanto, o direccionamento para o campo eléctrico é de 0,7 +/- 0,3 para a PRN-linha 1-1, e 0,2 +/- 0,8 para a linha PNT2 (Figura 5B). Os resultados mostram uma diferença significativa na galvanotaxis destas duas linhas celulares (p <0,01, as células foram rastreado…

Discussion

A análise da resposta galvanotaxis de uma célula tem sido um importante indicador funcional para muitos migratório celular ou crescimento processa ^{27, 28.} Aqui usamos uma câmara feito por encomenda com superfície de vidro para filmar duas linhas de células da próstata. Estas linhas de células demonstraram diferentes graus de galvanotaxis, e especula-se que a localização intracelular ou da activação das proteínas de mediar galvanotaxis pode ser interferido durante o processo de geração de linhas…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Cells
pRNS-1-1 prostate cells			Lee et. al., (1994)
PNT2 prostate cells	Sigma-Aldrich	95012613-1VL	Berthon et al., (1995)
Medium and solutions
RPMI 1640 medium	Invitrogen	11875-093	warm up to 37°C before use
Fetal Bovine Serum – Premium	Atlanta Biologicals	S11150	10% in PBS, warm up to 37°C before use
Antibiotic-Antimycotic (100x)	Life Technologies	15240	add 5mL to 500mL medium
2-propanol	VWR	BDH1133-5GL
PBS	–	–	137mM NaCl, 2.7mM KCl, 4.3mM Na2HPO4 and 1.5mM KH2PO4 in 1000mL of H2O, pH to 7.4 and autoclaved, warm up to 37°C before use
0.25% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200-056	warm up to 37°C before use, treat cells for 3-5 min at 37°C
Galvanotaxis device
Galvanotaxis chambers	Precision Plastics Inc, CA		custom-designed (1/4" X 2" X 3.5"), non-toxic, clear PVC chambers
Galvanotaxis electrodes	UCD electric shop		platinum coiled electrodes with flexable cords
Galvanotaxis power box	Substrate Engineering, CA		custom-designed DC power output with voltmeter
Microscope Cover Glass, Large, 45X50mm-No. 1.5	Fisher	12-544-F
Microscope Cover Glass, small, 25X25mm, No. 1	ThermoScientific	3307
Diamond point marker	ThermoScientific	750
Marine grade silicon sealer, clear	3M	051135-08019
High vacuum grease	Dow Corning	2021846-0807
6mL syringe	Fisher Scientific	05-561-64
Nichiryo Syringe, 1.5mL	Nichiryo	SG-M
Cotton applicators	Purtian Medical Products	806-WC
Qtips	Johnson & Johnson	729389
Nalgene 180 PVC tubing	Nalgene	8000-9030	503/16 ID x 5/16 OD x 1/16 Wall
Bacto-Agar	Difco	0140-01	make 2% agar solution
Razor Blade	Personna	74-0001
Equipments and Software
Benchtop Centrifuge	Eppendorf	5810R	operated with an A-4-62 rotor
Cellometer Auto T4	Nexcelom	Auto T4
Cellometer counting chambers	Nexcelom	CHT4-SD100-002	load 20uL cell solutions to count
Culture Temp Warming plate	Bel-Art Scienceware	370150000	to keep the galvanotaxis chambers at 37°C
Eclipse TE-2000 microscope with motorized stage and environmental chamber	Nikon
Plan Fluor 10X/0.30 objective len	Nikon
Retiga EX CCD camera	Qimaging		Cooled CCD camara, mono-color, 12-bit
Compressed air with 5% CO2	Airgas		special order
Volocity 6.3	PerkinElmer		Image acquiring software
Improvision OpenLab 5.5.2	PerkinElmer		Cell tracking software and customized to measure migration angles
FileMaker Pro Advanced, 8.0	FileMaker
Microsoft Excel 2008 for Mac	Microsoft