Utilisant conçus sur mesure galvanotaxie Chambers à étudier directionnel migration des cellules de la prostate

Summary

We present a method to apply a physiological electric field to migrating, immortalized prostate cells in a custom-made galvanotaxis chamber. Using this method, we demonstrate that 2 lines of non-tumorigenic prostate cells demonstrate different degrees of migration directionality in the field.

Abstract

Le champ électrique physiologique sert des fonctions biologiques spécifiques, telles que diriger la migration des cellules dans le développement embryonnaire, l'excroissance neuronale et la cicatrisation epitheliale. L'application d'un champ électrique à courant continu à des cellules cultivées in vitro induit la migration des cellules directionnel, ou galvanotaxie. Procédé de galvanotaxie deux dimensions nous démontrons ici est modifiée avec sur mesure poly (chlorure de vinyle) (PVC) chambres, la surface de verre, des électrodes en platine et l'utilisation d'une platine motorisée à laquelle les cellules sont imagés. Les chambres de PVC et des électrodes de platine présentent une faible cytotoxicité et sont abordables et ré-utilisable. La surface du verre et la platine du microscope motorisée améliorer la qualité des images et permettent d'éventuelles modifications de la surface du verre et des traitements aux cellules. Nous avons filmé l'galvanotaxie de deux, les lignées cellulaires non-tumorigènes SV40 immortalisé la prostate, PRNS-1-1 et PNT2. Ces deux lignées cellulaires montrent des vitesses de migration à la fois similaires et migrent versla cathode, mais ils montrent un degré différent de directivité dans galvanotaxie. Les résultats obtenus par l'intermédiaire de ce protocole suggérer que les PRNS-1-1 et les lignées cellulaires PNT2 peuvent avoir des caractéristiques intrinsèques qui régissent leurs réponses migrateurs directionnelles.

Introduction

Les champs électriques endogènes sont détectés dans divers tissus tels que la peau, ^{1, 32, 33} et ^deux cerveau. Le champ électrique physiologique sert des fonctions biologiques spécifiques, y compris diriger le développement des embryons ^{3, 4,} le guidage du prolongement de processus neuronaux ^{5, 6} et la promotion de l'épithélium et la cornée plaie fermeture ^{1, 7.} In vitro, l'application d'un champ électrique à courant continu à des cellules cultivées imite le champ électrique physiologique et induit la migration cellulaire directionnelle ou galvanotaxie. Galvanotaxie a été étudié dans des fibroblastes, des kératinocytes ^{8 9} de poisson, épithélial humain et les kératinocytes de la cornée ^{10 à 12,} les lymphocytes ^{13, deux} neuroblastes et les cellules progénitrices neuronales ^14. Lorsqu'il est exposé au champ appliqué, la majorité des cellules étudiées migrer de manière directionnelle vers l'cathodique pôle (-). Cependant, plusieurs cellules cancéreuses, y compris hautement métastatiquecellules de cancer du sein humain et la lignée cellulaire de cancer de la prostate humain PC-3M, se déplacent vers le anodique pôle (+) ^{15, 16.} Plusieurs mécanismes sont proposés à médiation galvanotaxie ou pour expliquer la capacité des cellules à détecter le champ électrique, y compris l'activation récepteurs de l'EGF ^12, le canal sodique épithélial ^17, PI3K et PTEN ^18, et la libération des ions calcium ^{15, 19.} Le mécanisme ne est pas encore entièrement compris et il est possible que de multiples voies de signalisation sont impliqués dans galvanotaxie.

Procédé de galvanotaxie deux dimensions nous démontrons ici est utile pour caractériser la migration directionnelle de adhérente, cellules mobiles, que ce soit pour surveiller la migration individuelle des cellules ^{10, 12, 17} ou la migration d'une feuille de cellules confluentes ^{18, 20.} Cette technique est modifiée à partir de Peng et Jaffe ²¹ et Nishimura et al., avec ¹⁰ chambres de PVC transparent sur ​​mesure, avec coversl amovibleips permettant l'extraction de cellules facile après galvanotaxie pour analyse secondaire, telles que l'imagerie immuno-fluorescence. La surface de verre des chambres de galvanotaxie est optique compatible, ce qui permet le tournage à fort grossissement et avec des cellules marquées par fluorescence. Il permet également la conception expérimentale avec modification de la surface du verre, par exemple modifier le revêtement ou la surface des charges. Entretoise en une lamelle n ° sont utilisés dans les chambres afin de minimiser le flux de courant dans les cellules; par conséquent, le chauffage par effet Joule, qui est proportionnelle au carré du flux de courant, ne serait pas surchauffer les cellules pendant l'expérience. Les ponts de liaison de gélose empêchent le contact direct des électrodes avec les cellules et empêchent le changement de pH du milieu ou de la concentration d'ions pendant galvanotaxie.

Deux lignes non-tumorigènes cellulaires prostate humaine ont été examinés pour leur réponse galvanotaxie dans cette étude. Les PRNS-1-1 ²² et ²³ sont à la fois PNT2 SV40 à immortalisation, les lignées cellulaires dépendantes de facteurs de croissance exprimant des marqueurs épithéliaux cytokératine 5, 8, 18 et 19 avec peu ou pas d'expression de l'antigène spécifique de la prostate (PSA). Les deux lignées cellulaires conservent la morphologie polygonale de cellules épithéliales normales, mais anomalie chromosomique a été observée dans le caryotype ^{22, 24.} Bien que PRN-1-1 et PNT2 part des comportements similaires dans la plupart des expériences, elles montrent des différences dans la formation de la structure et dans acineuses galvanotaxie. Sur une matrice 3-D, Matrigel, les cellules PRN-1-1 former des structures creuses avec des lumières acineuses ressemblant à la glande prostatique normale ²⁵ tissu. Cependant, les cellules forment des sphéroïdes solides PNT2 sans une lumière polarisée ou ²⁶ épithélium. Les cellules PRN-1-1 démontrent également une réponse plus élevée que la galvanotactic PNT2 dans la présente étude. La corrélation entre la formation de la structure acinaire et galvanotaxie dans PRNS-1-1 suggère que les signaux galvanotactic peuvent jouer un rôle dans l'organisation de la prles mouvements des tissus de la glande ostate en réponse à des champs électriques endogènes et fournit d'autres caractéristiques de discriminer entre ces deux lignées cellulaires.

Protocol

1. Culture de cellules de la prostate Culture les PRNS-1-1 et PNT2 prostate cellules sur des boîtes de 100 mm de la culture dans un milieu RPMI 1640 complété avec 10% de FBS et antibiotiques antimycosique à 37 ° C avec 5% de CO 2. Actualiser le milieu de culture tous les jours jusqu'à ce que les cellules atteignent 80% de confluence pour les expériences de galvanotaxie. 2. Assemblage galvanotaxie Chambers Assemblage chambres inférieures …

Representative Results

Deux lignes de cellules de la prostate (PRN-1-1 et PNT2) ont été étudiés avec cette méthode. Les cellules dans les deux lignes migrent à des vitesses similaires de 1,0 +/- 0,3 microns / min au cours de 2 heures (figure 5A). Cependant, la directivité du champ électrique est de 0,7 +/- 0,3-PRN pour la ligne 1-1, et 0,2 +/- 0,8 pour la ligne de PNT2 (figure 5B). Les résultats montrent une différence significative dans la galvanotaxie de ces deux lignées cellulaires (p <0,01, …

Discussion

L'analyse de la réponse d'une cellule de galvanotaxie a été un indicateur fonctionnel important pour un grand nombre de migration cellulaire ou la croissance des processus ^{27, 28.} Ici, nous utilisons une chambre sur mesure avec la surface de verre à film à deux lignées de cellules de la prostate. Ces lignées cellulaires ont démontré des degrés différents de galvanotaxie, et nous avons spéculé que la localisation intracellulaire ou l'activation des protéines de galvanotaxie-médiation…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Cells
pRNS-1-1 prostate cells			Lee et. al., (1994)
PNT2 prostate cells	Sigma-Aldrich	95012613-1VL	Berthon et al., (1995)
Medium and solutions
RPMI 1640 medium	Invitrogen	11875-093	warm up to 37°C before use
Fetal Bovine Serum – Premium	Atlanta Biologicals	S11150	10% in PBS, warm up to 37°C before use
Antibiotic-Antimycotic (100x)	Life Technologies	15240	add 5mL to 500mL medium
2-propanol	VWR	BDH1133-5GL
PBS	–	–	137mM NaCl, 2.7mM KCl, 4.3mM Na2HPO4 and 1.5mM KH2PO4 in 1000mL of H2O, pH to 7.4 and autoclaved, warm up to 37°C before use
0.25% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200-056	warm up to 37°C before use, treat cells for 3-5 min at 37°C
Galvanotaxis device
Galvanotaxis chambers	Precision Plastics Inc, CA		custom-designed (1/4" X 2" X 3.5"), non-toxic, clear PVC chambers
Galvanotaxis electrodes	UCD electric shop		platinum coiled electrodes with flexable cords
Galvanotaxis power box	Substrate Engineering, CA		custom-designed DC power output with voltmeter
Microscope Cover Glass, Large, 45X50mm-No. 1.5	Fisher	12-544-F
Microscope Cover Glass, small, 25X25mm, No. 1	ThermoScientific	3307
Diamond point marker	ThermoScientific	750
Marine grade silicon sealer, clear	3M	051135-08019
High vacuum grease	Dow Corning	2021846-0807
6mL syringe	Fisher Scientific	05-561-64
Nichiryo Syringe, 1.5mL	Nichiryo	SG-M
Cotton applicators	Purtian Medical Products	806-WC
Qtips	Johnson & Johnson	729389
Nalgene 180 PVC tubing	Nalgene	8000-9030	503/16 ID x 5/16 OD x 1/16 Wall
Bacto-Agar	Difco	0140-01	make 2% agar solution
Razor Blade	Personna	74-0001
Equipments and Software
Benchtop Centrifuge	Eppendorf	5810R	operated with an A-4-62 rotor
Cellometer Auto T4	Nexcelom	Auto T4
Cellometer counting chambers	Nexcelom	CHT4-SD100-002	load 20uL cell solutions to count
Culture Temp Warming plate	Bel-Art Scienceware	370150000	to keep the galvanotaxis chambers at 37°C
Eclipse TE-2000 microscope with motorized stage and environmental chamber	Nikon
Plan Fluor 10X/0.30 objective len	Nikon
Retiga EX CCD camera	Qimaging		Cooled CCD camara, mono-color, 12-bit
Compressed air with 5% CO2	Airgas		special order
Volocity 6.3	PerkinElmer		Image acquiring software
Improvision OpenLab 5.5.2	PerkinElmer		Cell tracking software and customized to measure migration angles
FileMaker Pro Advanced, 8.0	FileMaker
Microsoft Excel 2008 for Mac	Microsoft