Utilizzando a disegno Galvanotaxis Chambers per studiare la migrazione direzionale di cellule della prostata

Summary

We present a method to apply a physiological electric field to migrating, immortalized prostate cells in a custom-made galvanotaxis chamber. Using this method, we demonstrate that 2 lines of non-tumorigenic prostate cells demonstrate different degrees of migration directionality in the field.

Abstract

Il campo elettrico fisiologico serve funzioni biologiche specifiche, come dirigere la migrazione delle cellule in fase di sviluppo embrionale, escrescenza neuronale e epiteliale guarigione della ferita. L'applicazione di un campo elettrico in corrente continua a cellule coltivate in vitro induce migrazione cellulare direzionale, o galvanotaxis. Il metodo galvanotaxis 2-dimensionale dimostriamo qui viene modificato con poli misura (cloruro di vinile) (PVC) camere, superficie di vetro, elettrodi di platino e l'uso di uno stadio motorizzato su cui vengono esposte le cellule. Le camere di PVC e elettrodi di platino presentano bassa citotossicità e sono accessibili e riutilizzabili. La superficie di vetro e la fase di microscopio motorizzato migliorare la qualità delle immagini e consentono possibili modifiche alla superficie di vetro e trattamenti alle cellule. Abbiamo girato la galvanotaxis di due linee di cellule tumorali non-SV40-immortalata prostata, PRN-1-1 e pnt2. Queste due linee cellulari mostrano velocità di migrazione simili ed entrambe migrano versoil catodo, ma lo fanno mostrano un diverso grado di direzionalità in galvanotaxis. I risultati ottenuti con questo protocollo suggerire che i PRN-1-1 e le linee cellulari pnt2 possono avere diverse caratteristiche intrinseche che regolano le loro risposte migratori direzionali.

Introduction

Campi elettrici endogeni vengono rilevati in vari tessuti, come la pelle ^{1, 32, 33} e il cervello ^2. Il campo elettrico fisiologica serve funzioni biologiche specifiche, tra dirigere sviluppo embrionale ^{3, 4,} guidando la conseguenza di processi neuronali ^{5, 6} e promuovere cicatrizzazione corneale epiteliale e ^{1, 7.} In vitro, l'applicazione di un campo elettrico in corrente continua a cellule coltivate imita il campo elettrico fisiologico e induce migrazione cellulare direzionale, o galvanotaxis. Galvanotaxis è stato studiato in fibroblasti, cheratinociti ^{8 9} pesci, epiteliale umano e cheratinociti corneali ^10-12, linfociti ^13, neuroblasti ² e cellule progenitrici neuronali ^14. Se esposto al campo applicato, la maggioranza delle cellule studiate migrare direzionalmente verso il catodica (-) poli. Tuttavia, diverse cellule tumorali, tra cui altamente metastaticole cellule del cancro al seno umano e della prostata umano linea di cellule di cancro PC-3M, passare al anodica (+) Polo ^{15, 16.} Diversi meccanismi sono proposti a mediare galvanotaxis o per spiegare la capacità delle cellule di percepire il campo elettrico, tra cui l'attivazione recettori di EGF ^12, il canale del sodio epiteliale ^17, PI3K e PTEN ^18, e il rilascio di ioni calcio ^{15, 19.} Il meccanismo non è ancora completamente compresa ed è possibile che più vie di segnalazione sono coinvolti in galvanotaxis.

Il metodo galvanotaxis 2-dimensionale dimostriamo qui è utile per caratterizzare la migrazione direzionale aderenti, cellule mobili, sia per monitorare la migrazione singola cella ^{10, 12, 17} o migrazione di un foglio di cellule confluenti ^{18, 20.} Questa tecnica è modificato dal Peng e Jaffe ^21, e Nishimura et al. ¹⁰ con, camere di PVC trasparente su misura, con coversl rimovibileips consentendo il recupero delle cellule facile dopo galvanotaxis per l'analisi secondaria, come l'imaging immuno-fluorescenza. La superficie di vetro delle camere galvanotaxis è ottica compatibile, che consente le riprese ad alto ingrandimento e con cellule fluorescenza marcata. Inoltre permette il disegno sperimentale con modifica della superficie di vetro, ad esempio modificando il rivestimento o di superficie. Distanziatori realizzati No. 1 coprioggetti sono utilizzati nelle camere per minimizzare il flusso di corrente sulle celle; quindi il riscaldamento joule, che è proporzionale al quadrato del flusso di corrente, non surriscaldare le cellule durante l'esperimento. I ponti di collegamento agar impediscono il contatto diretto degli elettrodi con le cellule e prevenire cambiamenti del pH medio o concentrazione di ioni durante galvanotaxis.

Due linee cellulari di prostata umana non-cancerogeni sono stati esaminati per la loro risposta galvanotaxis in questo studio. I PRN-1-1 ²² e ²³ sono entrambi pnt2 SV40 immortalizzate, linee cellulari fattore dipendente dalla crescita esprimono marcatori epiteliali citocheratina 5, 8, 18 e 19 con bassa o nessuna espressione di antigene-specifica della prostata (PSA). Entrambe le linee cellulari mantengono la morfologia poligonale di cellule epiteliali normali, ma cromosoma anomalia è stata osservata in cariotipo ^{22, 24.} Sebbene PRN-1-1 e pnt2 condividono comportamenti simili nella maggior parte degli esperimenti, fanno mostrano differenze nella formazione della struttura e in acinose galvanotaxis. Su una matrice 3-D, Matrigel, i PRN-1-1 cellule formano strutture acinose cave con lumen che assomiglia alla prostata normale della ghiandola tessuto ^25. Tuttavia, le cellule pnt2 formano sferoidi solidi senza lumen o polarizzata dell'epitelio ^26. Le cellule PRN-1-1 dimostrano anche una risposta galvanotactic superiore alla pnt2 in questo studio. La correlazione tra la formazione della struttura acinar e galvanotaxis in PRN-1-1 suggerisce che i segnali galvanotactic possono svolgere un ruolo nell'organizzazione della prmovimenti tessuto ghiandolare ostate in risposta a campi elettrici endogeni, e fornisce ulteriori caratteristiche di discriminare tra queste linee cellulari 2.

Protocol

1. Le celle Culturing prostata Cultura dei PRN-1-1 e pnt2 prostata cellule in 100 piatti mm di coltura in RPMI 1640 supplementato con 10% FBS e antibiotici contro funghi a 37 ° C con il 5% di CO 2. Aggiornare il terreno di coltura ogni giorno fino a quando le cellule raggiungono 80% di confluenza per gli esperimenti galvanotaxis. 2. Montaggio Galvanotaxis Chambers Assemblaggio camere inferiori Pulire una camera galvanotaxis plastica con 2-prop…

Representative Results

Due linee di cellule della prostata (PRN-1-1 e pnt2) sono stati studiati con questo metodo. Cellule in entrambe le linee migrano a velocità simili di 1,0 +/- 0,3 micron / min nel corso di 2 ore (Figura 5A). Tuttavia, la direzionalità al campo elettrico è di 0,7 +/- 0,3 per l'PRN-1-1 riga e 0,2 +/- 0,8 per la linea pnt2 (Figura 5B). I risultati mostrano una differenza significativa nella galvanotaxis di queste due linee cellulari (p <0.01, 100 cellule sono state seguiti), sugge…

Discussion

L'analisi della risposta galvanotaxis di una cellula è stato un indicatore funzionale importante per molti migratori o crescita cellulare elabora ^{27, 28.} Qui usiamo una camera di misura con superficie di vetro per filmare due linee di cellule della prostata. Queste linee cellulari hanno dimostrato diversi gradi di galvanotaxis, e ipotizzano che la localizzazione intracellulare o l'attivazione delle proteine ​​galvanotaxis mediare potrebbero creare interferenze durante il processo di generazione d…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Cells
pRNS-1-1 prostate cells			Lee et. al., (1994)
PNT2 prostate cells	Sigma-Aldrich	95012613-1VL	Berthon et al., (1995)
Medium and solutions
RPMI 1640 medium	Invitrogen	11875-093	warm up to 37°C before use
Fetal Bovine Serum – Premium	Atlanta Biologicals	S11150	10% in PBS, warm up to 37°C before use
Antibiotic-Antimycotic (100x)	Life Technologies	15240	add 5mL to 500mL medium
2-propanol	VWR	BDH1133-5GL
PBS	–	–	137mM NaCl, 2.7mM KCl, 4.3mM Na2HPO4 and 1.5mM KH2PO4 in 1000mL of H2O, pH to 7.4 and autoclaved, warm up to 37°C before use
0.25% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200-056	warm up to 37°C before use, treat cells for 3-5 min at 37°C
Galvanotaxis device
Galvanotaxis chambers	Precision Plastics Inc, CA		custom-designed (1/4" X 2" X 3.5"), non-toxic, clear PVC chambers
Galvanotaxis electrodes	UCD electric shop		platinum coiled electrodes with flexable cords
Galvanotaxis power box	Substrate Engineering, CA		custom-designed DC power output with voltmeter
Microscope Cover Glass, Large, 45X50mm-No. 1.5	Fisher	12-544-F
Microscope Cover Glass, small, 25X25mm, No. 1	ThermoScientific	3307
Diamond point marker	ThermoScientific	750
Marine grade silicon sealer, clear	3M	051135-08019
High vacuum grease	Dow Corning	2021846-0807
6mL syringe	Fisher Scientific	05-561-64
Nichiryo Syringe, 1.5mL	Nichiryo	SG-M
Cotton applicators	Purtian Medical Products	806-WC
Qtips	Johnson & Johnson	729389
Nalgene 180 PVC tubing	Nalgene	8000-9030	503/16 ID x 5/16 OD x 1/16 Wall
Bacto-Agar	Difco	0140-01	make 2% agar solution
Razor Blade	Personna	74-0001
Equipments and Software
Benchtop Centrifuge	Eppendorf	5810R	operated with an A-4-62 rotor
Cellometer Auto T4	Nexcelom	Auto T4
Cellometer counting chambers	Nexcelom	CHT4-SD100-002	load 20uL cell solutions to count
Culture Temp Warming plate	Bel-Art Scienceware	370150000	to keep the galvanotaxis chambers at 37°C
Eclipse TE-2000 microscope with motorized stage and environmental chamber	Nikon
Plan Fluor 10X/0.30 objective len	Nikon
Retiga EX CCD camera	Qimaging		Cooled CCD camara, mono-color, 12-bit
Compressed air with 5% CO2	Airgas		special order
Volocity 6.3	PerkinElmer		Image acquiring software
Improvision OpenLab 5.5.2	PerkinElmer		Cell tracking software and customized to measure migration angles
FileMaker Pro Advanced, 8.0	FileMaker
Microsoft Excel 2008 for Mac	Microsoft