전립선 세포의 방향 마이그레이션 연구에 맞춤 설계 Galvanotaxis 챔버를 활용

Summary

We present a method to apply a physiological electric field to migrating, immortalized prostate cells in a custom-made galvanotaxis chamber. Using this method, we demonstrate that 2 lines of non-tumorigenic prostate cells demonstrate different degrees of migration directionality in the field.

Abstract

생리 전기장은 배아 발달, 신경 가지 상피 상처 치유에 세포의 이동을 지시하는 등 특정 생물학적 기능을 제공합니다. 시험 관내에서 배양 된 세포에 직류 전계를인가하여 세포의 이동 방향, 또는 galvanotaxis을 유도한다. 여기 보여 2 차원 galvanotaxis 방법은 주문 제작 된 폴리 (비닐 클로라이드) (PVC) 챔버, 유리 표면에, 백금 전극과 셀 묘화되는 동력 스테이지를 이용하여 수정된다. PVC 챔버 및 백금 전극은 낮은 세포 독성을 전시하고 저렴하고 다시 사용 가능한입니다. 유리 표면과 전동 현미경 스테이지는 이미지의 품질을 개선하고 세포에 유리 표면과 치료 가능한 수정을 허용한다. 우리는 두 가지 비 – 종양 형성, SV40-전립선 무한 증식 세포주, PRNS-1-1의 PNT2 galvanotaxis을 촬영. 이들 두 세포주는 유사한 이동 속도를 보여 모두를 향해 이동음극,하지만 그들은 galvanotaxis의 방향성의 다른 정도를 보여 않습니다. 이 프로토콜을 통해 얻어진 결과 PRNS-1-1 PNT2 세포주들은 지향성 응답 이동성을 관리 다른 고유 특성을 가질 수 있음을 시사한다.

Introduction

내인성 전기장 피부 ^{1, 32, 33, 2와} 같은 다양한 뇌 조직에서 검출된다. 생리 전계 신경 공정 ^{5, 6의} 생장을 유도하고 상피 각막 상처 봉합 ^{1,7 촉진} 지향, 배 발달 ^3,4- 포함한 특정 생물학적 기능을 제공. 시험관 내 배양 된 세포에 직류 전계인가 모방 생리 전기장을하고 방향 세포의 이동, 또는 galvanotaxis를 유도한다. Galvanotaxis는 neuroblasts ^2, 신경 전구 세포 ^(14), 섬유 아세포 ^8, 물고기 각질 ^9, 인간 상피와 각막 각질 ^10-12 연구 ¹³ 림프구되었습니다. (-) 극인가 필드에 노출되는 경우, 세포 연구의 대부분은 방향성 cathodal 향해 이동한다. 그러나, 고도 등 여러 전이성 암세포인간의 유방암 세포와 인간 전립선 암 세포주 PC-3M이 anodal (+) 극 ^{(15, 16)로} 이동한다. 여러 메커니즘 galvanotaxis을 중재 또는 활성화를 포함하는 전기장을 감지하는 세포의 능력을 설명하기 위해 제안 EGF ¹² 수용체, 상피 나트륨 채널 ^(17)는 PI3K 및 PTEN ^(18), 및 칼슘의 방출이기구는 아직 완전히 이해되지. ^{15 (19)} 이온 및 그것은 여러 신호 전달 경로가 galvanotaxis에 참여하는 것이 가능하다.

여기 보여 2 차원 galvanotaxis 방법은 점착성, 운동성 세포의 방향 이동을 특성화하기 위해, 하나 ^{(18), (20).이} 기법에서 수정 된 융합 세포의 시트를 개개의 세포 이동을 ^{10, 12, 17} 또는 이동을 모니터링하는 데 유용 펭과 제피 ^(21), 그리고 니시무라 등. 주문 제작, 명확한 PVC 챔버 ^10, 이동식 coversl와IPS와 같은 면역 형광 이미징 차 분석을위한 galvanotaxis, 후 쉽게 셀 검색을 허용. galvanotaxis 챔버의 유리 표면은 고배율과 형광 표지 된 세포와 촬영을 허용하는 광학 호환이다. 그것은 또한 표면 코팅 또는 전하 변경과 같은, 유리의 표면 개질과 실험 설계를 허용한다. 제 1 커버 글라스로 이루어지는 스페이서 위에 셀 전류 흐름을 최소화하기 위해 챔버에 사용된다; 따라서, 전류 흐름의 제곱에 비례 주울 가열, 실험 기간 동안 세포를 과열 않을 것이다. 한천 연결 교량 셀 전극의 직접 접촉을 방지하고 galvanotaxis 동안 매체의 pH 나 이온 농도의 변화를 방지한다.

두 개의 비 – 인간 종 양성 전립선 세포주는이 연구에서 galvanotaxis 그들의 응답을 조사 하였다. PRNS-1-1 ²² PNT2 ^(23)는 모두 SV4 있습니다성장 인자 의존적 세포주는 전립선 특이 항원 (PSA)의 낮은 또는 전혀 식 5, 8, 18, 19 아세포 상피 마커를 발현하는, 0 – 불멸화. 두 세포주 정상 상피 세포의 다각형 형태를 유지하지만, 염색체 이상은 핵형 ^{(22, 24)에서} 관찰되었다. PRNS-1-1과 PNT2 대부분의 실험에서 유사한 행동을 공유하지만, 그들이 선포 구조의 형성과의 차이를 표시 할 galvanotaxis. 3-D 행렬에, 마트 리겔은 PRNS-1-1 세포는 정상적인 전립선 조직 ^(25)을 닮은 루멘 선포의 중공 구조를 형성한다. 그러나 PNT2 세포 내강 상피 ⁽²⁶⁾ 또는 편광없이 고체 스페 로이드를 형성한다. PRNS-1-1 세포는 또한 현재 연구 PNT2보다 높은 galvanotactic 응답을 보여준다. 선포의 구조의 형성 및 galvanotaxis 간의 상관 관계는 PRNS-1-1 galvanotactic 신호 (PR)를 조직에서 역할을 할 수 있음을 시사ostate 선 조직 내생 전기장에 대응 움직임, 그리고이 두 세포주를 구별하기 위해 추가 특성을 제공한다.

Protocol

1. 배양 전립선 세포 문화 PRNS-1-1 5 % CO 2, 37 ℃에서 10 % FBS와 항생제 – 안티 곰팡이로 보충 된 RPMI 1640 배지에서 100mm 배양 접시에 PNT2 및 전립선 세포. 세포 galvanotaxis 실험에 80 % 포화 상태에 도달 할 때까지 매일 배양 배지를 새로. 2. 조립 Galvanotaxis 챔버 하단 챔버 조립 2- 프로판올와 플라스틱 galvanotaxis 챔버를 닦습니다. 주사기와 챔버의 하부…

Representative Results

전립선 세포 (PRNS-1-1과 PNT2)의 두 라인은이 방법으로 조사 하였다. 두 줄의 셀은 2 시간 (도 5a)에 걸쳐 1.0 +/- 0.3 미크론 / 분의 속도로 이동 유사한. 그러나, 전계 지향성 PRNS-1-1 선 0.7 +/- 0.3 및 PNT2 라인 (도 5B) 0.2 +/- 0.8이다. 결과들은 상이한 위치 단서 지향성 응답이 발생할 다른 세포 시그널링 메커니즘을 가지고 있음을 시사 (100 세포 추적 하였다 p <0.01)이 두 세포주 galvano…

Discussion

셀의 galvanotaxis 응답의 분석은 많은 셀룰러 이동성 또는 성장을위한 중요한 기능 표시기 ^{(27), (28)를} 처리했다. 여기서 우리는 두 전립선 세포주 영화를 유리 표면에 특별 주문품 실을 사용한다. 이들 세포주 galvanotaxis 상이한 정도를 보여, 우리는 세포 내 위치 파악 또는 galvanotaxis – 매개 단백질의 활성화는 galvanotaxis 응답의 관측 차이의 결과로, 불멸 세포주를 생성하는 과정을 방해 할 수 있…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Cells
pRNS-1-1 prostate cells			Lee et. al., (1994)
PNT2 prostate cells	Sigma-Aldrich	95012613-1VL	Berthon et al., (1995)
Medium and solutions
RPMI 1640 medium	Invitrogen	11875-093	warm up to 37°C before use
Fetal Bovine Serum – Premium	Atlanta Biologicals	S11150	10% in PBS, warm up to 37°C before use
Antibiotic-Antimycotic (100x)	Life Technologies	15240	add 5mL to 500mL medium
2-propanol	VWR	BDH1133-5GL
PBS	–	–	137mM NaCl, 2.7mM KCl, 4.3mM Na2HPO4 and 1.5mM KH2PO4 in 1000mL of H2O, pH to 7.4 and autoclaved, warm up to 37°C before use
0.25% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200-056	warm up to 37°C before use, treat cells for 3-5 min at 37°C
Galvanotaxis device
Galvanotaxis chambers	Precision Plastics Inc, CA		custom-designed (1/4" X 2" X 3.5"), non-toxic, clear PVC chambers
Galvanotaxis electrodes	UCD electric shop		platinum coiled electrodes with flexable cords
Galvanotaxis power box	Substrate Engineering, CA		custom-designed DC power output with voltmeter
Microscope Cover Glass, Large, 45X50mm-No. 1.5	Fisher	12-544-F
Microscope Cover Glass, small, 25X25mm, No. 1	ThermoScientific	3307
Diamond point marker	ThermoScientific	750
Marine grade silicon sealer, clear	3M	051135-08019
High vacuum grease	Dow Corning	2021846-0807
6mL syringe	Fisher Scientific	05-561-64
Nichiryo Syringe, 1.5mL	Nichiryo	SG-M
Cotton applicators	Purtian Medical Products	806-WC
Qtips	Johnson & Johnson	729389
Nalgene 180 PVC tubing	Nalgene	8000-9030	503/16 ID x 5/16 OD x 1/16 Wall
Bacto-Agar	Difco	0140-01	make 2% agar solution
Razor Blade	Personna	74-0001
Equipments and Software
Benchtop Centrifuge	Eppendorf	5810R	operated with an A-4-62 rotor
Cellometer Auto T4	Nexcelom	Auto T4
Cellometer counting chambers	Nexcelom	CHT4-SD100-002	load 20uL cell solutions to count
Culture Temp Warming plate	Bel-Art Scienceware	370150000	to keep the galvanotaxis chambers at 37°C
Eclipse TE-2000 microscope with motorized stage and environmental chamber	Nikon
Plan Fluor 10X/0.30 objective len	Nikon
Retiga EX CCD camera	Qimaging		Cooled CCD camara, mono-color, 12-bit
Compressed air with 5% CO2	Airgas		special order
Volocity 6.3	PerkinElmer		Image acquiring software
Improvision OpenLab 5.5.2	PerkinElmer		Cell tracking software and customized to measure migration angles
FileMaker Pro Advanced, 8.0	FileMaker
Microsoft Excel 2008 for Mac	Microsoft