Utnytte Spesialdesignede Galvanotaxis Chambers å studere Retnings Migrasjon av prostata celler

Summary

We present a method to apply a physiological electric field to migrating, immortalized prostate cells in a custom-made galvanotaxis chamber. Using this method, we demonstrate that 2 lines of non-tumorigenic prostate cells demonstrate different degrees of migration directionality in the field.

Abstract

Den fysiologiske elektriske feltet serverer spesifikke biologiske funksjoner, som for eksempel å dirigere celle migrasjon i embryo utvikling, nevronale utvekst og epitel sårtilheling. Påføring av en likestrøm elektrisk felt til dyrkede celler in vitro induserer retningscellemigrering eller galvanotaxis. Den to-dimensjonale galvanotaxis metode demonstrerer vi her er modifisert med skreddersydd poly (vinylklorid) (PVC) kammer, glassoverflaten, platinaelektroder, og bruk av en motorisert stadium hvor cellene er avbildet. PVC kamre og platina elektroder viser lav cytotoksisitet og er rimelig og re-brukbar. Glassoverflaten og den motoriserte objektbord forbedre kvaliteten av bildene og tillate mulige modifikasjoner av glassoverflaten og behandlinger til cellene. Vi filmet galvanotaxis av to ikke-tumorigene, SV40-udødelig prostata cellelinjer, pRNS-1-1 og PNT2. Disse to cellelinjer viser lignende migrasjons hastigheter og begge migrere motkatoden, men de viser en annen grad av retnings i galvanotaxis. Resultatene oppnådd via denne protokollen resultatene tyder på at pRNS-1-1 og PNT2 cellelinjer kan ha ulike iboende egenskaper som styrer sine retnings trekkende svar.

Introduction

Endogene elektriske felt blir detektert i forskjellige vev, slik som hud ^{1, 32, 33} og hjerne ^2. Den fysiologiske elektriske felt tjener spesifikke biologiske funksjoner, inkludert dirigere embryoutvikling ^{3, 4,} føring av utvekst av neuronal prosesser ^{5, 6} og fremme epitelial og hornhinnen til lukking av sår ^{1, 7.} In vitro anvendelse av et likestrøms elektrisk felt til dyrkede celler ligner den fysiologiske elektrisk felt og induserer retningscellemigrasjon, eller galvanotaxis. Galvanotaxis har blitt studert i fibroblaster ^8, fisk keratinocytter ^9, menneskelig epitel og hornhinnen keratinocytter ^10-12, lymfocytter ^13, neuroblasts ^to, og nevrale stamceller ^14. Når de utsettes for den påtrykte felt, de fleste undersøkte celler migrerer retnings mot katodisk (-) pol. Likevel, flere kreftceller, inkludert svært metastatiskhumane brystcancer-celler og den humane prostatacancercellelinje PC-3M, går til anodisk (+) pol ^{15, 16.} Flere mekanismer er foreslått å mediere galvanotaxis eller for å forklare evnen til cellene for å avføle det elektriske felt, inkludert aktivering av EGF-reseptorer ^12, epithelial natriumkanal ^17, PI3K og PTEN ^18, og frigjøring av kalsiumioner ^{15, 19.} Mekanismen er ennå ikke fullt ut forstått, og det er mulig at flere signalveier er involvert i galvanotaxis.

Den to-dimensjonale galvanotaxis metode demonstrerer vi her er nyttig for å karakterisere retnings migrasjon av fastsittende, bevegelige celler, enten for å overvåke enkeltcellemigrering ^{10, 12, 17} eller migrering av en plate av konfluente celler ^{18, 20.} Denne teknikken er modifisert fra Peng og Jaffe ^21, og Nishimura et al. ¹⁰ med skreddersydde, klare PVC kamre, med avtagbart coverslips muliggjør enkel celle gjenfinning etter galvanotaxis for sekundær analyse, for eksempel immuno-fluorescens bildebehandling. Glassoverflaten av galvanotaxis kamrene er optisk-kompatibel, noe som gjør det mulig for filming ved høy forstørrelse og med fluoresceinmerkede celler. Den gjør også eksperimentell design med modifisering av glassoverflaten, for eksempel endring av overflatebelegg eller avgifter. Avstandsstykker laget av No. en dekkglass brukes i kamrene for å redusere strømflyten over cellene; derfor joule-varme, som er proporsjonal med kvadratet av strømmen som føres, ikke ville bli overopphetet cellene i løpet av eksperimentet. Forbindelses agar broer forhindre direkte kontakt av elektroder med cellene og hindre endring av pH i mediet eller ion konsentrasjon under galvanotaxis.

To ikke-tumorigene humane prostatacellelinjer ble undersøkt for sin respons galvanotaxis i denne studien. De pRNS-1-1 ²² og PNT2 ²³ er både SV40-udødeliggjort, vekstfaktoravhengige cellelinjer som uttrykker de epiteliale markører cytokeratin 5, 8, 18 og 19 med lav eller ingen ekspresjon av prostata spesifikt antigen (PSA). Begge cellelinjer opprettholde polygonal morfologi av normale epitelceller, men kromosom abnormalitet ble observert i karyotypering ^{22, 24.} Selv pRNS-1-1 og PNT2 dele lignende adferd i de fleste eksperimenter, de viser forskjeller i dannelsen av acinar struktur og i galvanotaxis. På en 3-D matrise, Matrigel, de pRNS-1-1 cellene danner hul acinar strukturer med lumen likner den normale vevet prostatakjertelen ^25. Imidlertid PNT2 cellene danne faste kuler uten hulrom eller polarisert epitel ^26. De pRNS-1-1 celler også demonstrere en høyere galvanotactic respons enn PNT2 i den aktuelle studien. Korrelasjonen mellom dannelsen av acinar struktur og galvanotaxis i pRNS-1-1 tyder på at de galvanotactic signaler kan spille en rolle i organiseringen av prostate kjertel vev bevegelser i respons til endogene elektriske felt, og gir ytterligere egenskaper for å diskriminere mellom disse to cellelinjer.

Protocol

1. Dyrking Prostata Cells Kultur de pRNS-1-1 og PNT2 prostata celler på 100 mm kultur retter i RPMI 1640 medium supplert med 10% FBS og Antibiotika fungal ved 37 ° C med 5% CO 2. Oppdatere dyrkingsmediumet hver dag frem til cellene nå 80% confluency for galvanotaxis eksperimenter. 2. Montere Galvanotaxis Chambers Montering bunn kamre Tørk en plast galvanotaxis kammer med 2-propanol. Påfør marine grade silisium sealer rundt sirkulære åpn…

Representative Results

To linjer med prostata celler (pRNS-1-1 og PNT2) ble undersøkt med denne metoden. Celler i begge linjer migrere ved lignende hastigheter på 1,0 +/- 0,3 mikron / min i løpet av 2 timer (figur 5A). Imidlertid er den retnings til det elektriske felt på 0,7 +/- 0,3 for pRNS-1-1-linjen, og 0,2 +/- 0,8 for PNT2 linjen (figur 5B). Resultatene viser en betydelig forskjell i galvanotaxis av disse to cellelinjer (p <0,01, ble 100 celler spores), noe som tyder på at de har forskjellige cel…

Discussion

Analysen av en celles galvanotaxis responsen har vært en viktig funksjonell indikator for mange mobil trekkfugl eller vekstprosesser ^{27, 28.} Her bruker vi en skreddersydd kammer med glassoverflate for å filme to prostata cellelinjer. Disse cellelinjene viste forskjellige grader av galvanotaxis, og vi spekulerer i at den intracellulære lokalisering eller aktivering av galvanotaxis-medierende proteiner kan bli forstyrret i løpet av prosessen med å generere de udødelige cellelinjer, noe som resulterer i de…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Cells
pRNS-1-1 prostate cells			Lee et. al., (1994)
PNT2 prostate cells	Sigma-Aldrich	95012613-1VL	Berthon et al., (1995)
Medium and solutions
RPMI 1640 medium	Invitrogen	11875-093	warm up to 37°C before use
Fetal Bovine Serum – Premium	Atlanta Biologicals	S11150	10% in PBS, warm up to 37°C before use
Antibiotic-Antimycotic (100x)	Life Technologies	15240	add 5mL to 500mL medium
2-propanol	VWR	BDH1133-5GL
PBS	–	–	137mM NaCl, 2.7mM KCl, 4.3mM Na2HPO4 and 1.5mM KH2PO4 in 1000mL of H2O, pH to 7.4 and autoclaved, warm up to 37°C before use
0.25% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200-056	warm up to 37°C before use, treat cells for 3-5 min at 37°C
Galvanotaxis device
Galvanotaxis chambers	Precision Plastics Inc, CA		custom-designed (1/4" X 2" X 3.5"), non-toxic, clear PVC chambers
Galvanotaxis electrodes	UCD electric shop		platinum coiled electrodes with flexable cords
Galvanotaxis power box	Substrate Engineering, CA		custom-designed DC power output with voltmeter
Microscope Cover Glass, Large, 45X50mm-No. 1.5	Fisher	12-544-F
Microscope Cover Glass, small, 25X25mm, No. 1	ThermoScientific	3307
Diamond point marker	ThermoScientific	750
Marine grade silicon sealer, clear	3M	051135-08019
High vacuum grease	Dow Corning	2021846-0807
6mL syringe	Fisher Scientific	05-561-64
Nichiryo Syringe, 1.5mL	Nichiryo	SG-M
Cotton applicators	Purtian Medical Products	806-WC
Qtips	Johnson & Johnson	729389
Nalgene 180 PVC tubing	Nalgene	8000-9030	503/16 ID x 5/16 OD x 1/16 Wall
Bacto-Agar	Difco	0140-01	make 2% agar solution
Razor Blade	Personna	74-0001
Equipments and Software
Benchtop Centrifuge	Eppendorf	5810R	operated with an A-4-62 rotor
Cellometer Auto T4	Nexcelom	Auto T4
Cellometer counting chambers	Nexcelom	CHT4-SD100-002	load 20uL cell solutions to count
Culture Temp Warming plate	Bel-Art Scienceware	370150000	to keep the galvanotaxis chambers at 37°C
Eclipse TE-2000 microscope with motorized stage and environmental chamber	Nikon
Plan Fluor 10X/0.30 objective len	Nikon
Retiga EX CCD camera	Qimaging		Cooled CCD camara, mono-color, 12-bit
Compressed air with 5% CO2	Airgas		special order
Volocity 6.3	PerkinElmer		Image acquiring software
Improvision OpenLab 5.5.2	PerkinElmer		Cell tracking software and customized to measure migration angles
FileMaker Pro Advanced, 8.0	FileMaker
Microsoft Excel 2008 for Mac	Microsoft