Använda Skräddarsydda Galvanotaxis Chambers att studera Directional Migration av prostataceller

Summary

We present a method to apply a physiological electric field to migrating, immortalized prostate cells in a custom-made galvanotaxis chamber. Using this method, we demonstrate that 2 lines of non-tumorigenic prostate cells demonstrate different degrees of migration directionality in the field.

Abstract

Den fysiologiska elektriska fältet tjänar specifika biologiska funktioner, såsom att rikta cellmigration i embryoutvecklingen, neuronal utväxt och epitelial sårläkning. Att ansluta en likström elektriskt fält till odlade celler in vitro inducerar riktad cellmigrering, eller galvanotaxis. Den två-dimensionella galvanotaxis metod vi demonstrera här är modifierad med skräddarsydd poly (vinylklorid) (PVC) kammare, glasytan, platinaelektroder och användning av en motoriserad scen på vilken cellerna avbildas. PVC kammare och platinaelektroder uppvisar låg cytotoxicitet och är prisvärda och återanvändbara. Den glasytan och det motoriserade mikroskop skede förbättra kvaliteten på bilder och tillåta eventuella ändringar av glasytan och behandlingar till cellerna. Vi filmade galvanotaxis av två icke-tumörframkallande, SV40-odödligprostata cellinjer, PRNS-1-1 och PNT2. Dessa två cellinjer visar liknande migrationshastigheter och båda vandrar motkatoden, men de visar olika grad av riktnings i galvanotaxis. De resultat som erhölls via detta protokoll tyder på att PRN-1-1 och cellinjer PNT2 kan ha olika inneboende egenskaper som styr deras riktningsflytt svar.

Introduction

Endogena elektriska fält detekteras i olika vävnader, såsom hud ^{1, 32, 33} och hjärna ^2. Den fysiologiska elektriska fältet tjänar specifika biologiska funktioner, inklusive styra embryoutveckling ^{3, 4,} styra utväxt av neuronala processer ^{5, 6} och främja epitelial och hornhinnans sårtillslutning ^{1, 7.} In vitro applicering av en likström elektriskt fält till odlade celler härmar fysiologiska elektriska fält och inducerar riktad cellmigration, eller galvanotaxis. Galvanotaxis har studerats hos fibroblaster ^8, fisk keratinocyter ^9, mänsklig epitelial och hornhinnan keratinocyter ^10-12, lymfocyter ^13, neuroblaster ² och neuronala stamceller ^14. När de utsätts för den pålagda fältet, de flesta studerade celler migrerar riktnings mot katod (-) pol. Ändå flera cancerceller, inklusive mycket metastatiskahumana bröstcancerceller och den humana prostatacancer-cellinje PC-3M, flytta till anodala (+) polen ^{15, 16.} föreslås Flera mekanismer för att mediera galvanotaxis eller att förklara förmågan hos cellerna att avkänna det elektriska fältet, inklusive aktivering av EGF-receptorer ^12, epitelial natriumkanalen ^17, PI3K och PTEN ^18, och frisättning av kalciumjoner ^{15, 19.} Mekanismen är ännu inte helt klarlagt och det är möjligt att multipla signalvägar är involverade i galvanotaxis.

Den två-dimensionella galvanotaxis metod vi demonstrera här är användbar för att karakterisera den riktnings migration av vidhäftande, motila celler, antingen för att övervaka enskilda cellmigration ^{10, 12, 17} eller migrering av ett ark av konfluenta celler ^{18, 20.} Denna teknik är modifierad från al. Peng och Jaffe ^21, och Nishimura et ¹⁰ med skräddarsydda, klara PVC kammare, med avtagbar coverslips vilket möjliggör enkel cell hämtning efter galvanotaxis för sekundäranalys, såsom immun fluorescens avbildning. Den glasyta galvanotaxis kamrarna är optisk-kompatibel, vilket möjliggör inspelningen vid hög förstoring och med fluorescensmärkta celler. Det gör också den experimentella designen med modifiering av glasytan, till exempel att ändra ytbeläggningen eller avgifter. Distanser gjorda av nr 1 täckglas används i kamrarna för att minimera strömflödet över cellerna; därför den Joule-uppvärmning, som är proportionell mot kvadraten på strömflödet, inte skulle överhettas cellerna under experimentet. De anslut agar broar förhindra direkt kontakt av elektroderna med cellerna och förhindra förändring av mediets pH eller jonkoncentration under galvanotaxis.

Undersöktes Två icke-tumorigena humana prostatacellinjer för sin galvanotaxis svar i denna studie. De PRN-1-1 ²² och PNT2 ²³ är både SV40-immortaliserade, tillväxtfaktorberoende cellinjer som uttrycker de epiteliala markörer cytokeratin 5, 8, 18 och 19 med låg eller ingen expression av prostataspecifikt antigen (PSA). Båda cellinjerna bibehålla den polygonala morfologi av normala epitelceller, men kromosom abnormitet observerades i karyotypning ^{22, 24.} Fastän PRN-1-1 och PNT2 delar liknande beteenden i de flesta experiment, de visar skillnader i bildningen av acinar struktur och i galvanotaxis. På en 3-D-matris, Matrigel, de PRN-1-1 celler bildar ihåliga acinära strukturer med lumen liknar den normala prostatakörteln vävnad ^25. Men de PNT2 cellerna bilda fasta sfäroider utan lumen eller polariserad epitel ^26. De PRN-1-1 celler visar också en högre galvanotactic respons än den PNT2 i den aktuella studien. Korrelationen mellan bildandet av acinar struktur och galvanotaxis i PRN-1-1 antyder att de galvanotactic signalerna kan spela en roll i att organisera prostate körtel vävnad rörelser som svar på endogena elektriska fält, och ger ytterligare egenskaper för att skilja mellan dessa två cellinjer.

Protocol

1. Odling prostateceller Kultur de PRN-1-1 och PNT2 prostateceller på 100 mm odlingsskålar i RPMI 1640-medium kompletterat med 10% FBS och Antibiotika Antimykotisk vid 37 ° C med 5% CO2. Uppdatera odlingsmediet varje dag tills cellerna når 80% konfluens för galvanotaxis experiment. 2. Montering Galvanotaxis Chambers Hopsättning bottenkamrarna Torka en plast galvanotaxis kammare med 2-propanol. Applicera marint kisel sealer runt de cirkul?…

Representative Results

Två rader av prostataceller (PRN-1-1 och PNT2) undersöktes med denna metod. Celler i båda linjerna migrera vid liknande hastigheter på 1.0 +/- 0,3 mikrometer / min under loppet av 2 timmar (Figur 5A). Emellertid, den riktverkan till det elektriska fältet är 0,7 +/- 0,3 för PRN-1-1 linje, och 0,2 +/- 0,8 för PNT2 linjen (figur 5B). Resultaten visar en signifikant skillnad i galvanotaxis av dessa två cellinjer (p <0,01, var 100 celler spåras), vilket tyder på att de har olik…

Discussion

Analysen av en cells galvanotaxis svar har varit en viktig funktionell indikator för många cell vandrande eller tillväxt processer ^{27, 28.} Här använder vi en skräddarsydd kammare med glasytan att filma två prostata cellinjer. Dessa cellinjer har visat olika grad av galvanotaxis, och vi spekulera i att den intracellulära lokaliseringen eller aktiveringen av galvanotaxis förmedlande proteiner kan störas under processen för att generera de odödliga cellinjer, vilket resulterar i den observerade skill…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Cells
pRNS-1-1 prostate cells			Lee et. al., (1994)
PNT2 prostate cells	Sigma-Aldrich	95012613-1VL	Berthon et al., (1995)
Medium and solutions
RPMI 1640 medium	Invitrogen	11875-093	warm up to 37°C before use
Fetal Bovine Serum – Premium	Atlanta Biologicals	S11150	10% in PBS, warm up to 37°C before use
Antibiotic-Antimycotic (100x)	Life Technologies	15240	add 5mL to 500mL medium
2-propanol	VWR	BDH1133-5GL
PBS	–	–	137mM NaCl, 2.7mM KCl, 4.3mM Na2HPO4 and 1.5mM KH2PO4 in 1000mL of H2O, pH to 7.4 and autoclaved, warm up to 37°C before use
0.25% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200-056	warm up to 37°C before use, treat cells for 3-5 min at 37°C
Galvanotaxis device
Galvanotaxis chambers	Precision Plastics Inc, CA		custom-designed (1/4" X 2" X 3.5"), non-toxic, clear PVC chambers
Galvanotaxis electrodes	UCD electric shop		platinum coiled electrodes with flexable cords
Galvanotaxis power box	Substrate Engineering, CA		custom-designed DC power output with voltmeter
Microscope Cover Glass, Large, 45X50mm-No. 1.5	Fisher	12-544-F
Microscope Cover Glass, small, 25X25mm, No. 1	ThermoScientific	3307
Diamond point marker	ThermoScientific	750
Marine grade silicon sealer, clear	3M	051135-08019
High vacuum grease	Dow Corning	2021846-0807
6mL syringe	Fisher Scientific	05-561-64
Nichiryo Syringe, 1.5mL	Nichiryo	SG-M
Cotton applicators	Purtian Medical Products	806-WC
Qtips	Johnson & Johnson	729389
Nalgene 180 PVC tubing	Nalgene	8000-9030	503/16 ID x 5/16 OD x 1/16 Wall
Bacto-Agar	Difco	0140-01	make 2% agar solution
Razor Blade	Personna	74-0001
Equipments and Software
Benchtop Centrifuge	Eppendorf	5810R	operated with an A-4-62 rotor
Cellometer Auto T4	Nexcelom	Auto T4
Cellometer counting chambers	Nexcelom	CHT4-SD100-002	load 20uL cell solutions to count
Culture Temp Warming plate	Bel-Art Scienceware	370150000	to keep the galvanotaxis chambers at 37°C
Eclipse TE-2000 microscope with motorized stage and environmental chamber	Nikon
Plan Fluor 10X/0.30 objective len	Nikon
Retiga EX CCD camera	Qimaging		Cooled CCD camara, mono-color, 12-bit
Compressed air with 5% CO2	Airgas		special order
Volocity 6.3	PerkinElmer		Image acquiring software
Improvision OpenLab 5.5.2	PerkinElmer		Cell tracking software and customized to measure migration angles
FileMaker Pro Advanced, 8.0	FileMaker
Microsoft Excel 2008 for Mac	Microsoft