كفاءة الجذع الجيل خلية من الدم عن طريق Episomes وHDAC المانعون
Summary
نحن هنا وصف بروتوكول لتوليد الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها الإنسان من الدم المحيطي باستخدام استراتيجية إعادة برمجة يصبوغ مقرها ومثبطات deacetylase هيستون.
Abstract
وتوضح هذه المخطوطة بروتوكول لخلق بكفاءة من صنع الإنسان خلايا خالية من التكامل الجذعية المحفزة (iPSCs) من الدم المحيطي باستخدام البلازميدات episomal وdeacetylase هيستون (HDAC) مثبطات. مزايا هذا النهج ما يلي: (1) استخدام كمية ضئيلة من الدم المحيطي كمادة المصدر؛ (2) nonintegrating ناقلات إعادة برمجة. (3) وسيلة فعالة من حيث التكلفة لتوليد iPSCs خالية النواقل؛ (4) وترنسفكأيشن واحد؛ و (5) استخدام جزيئات صغيرة لتسهيل إعادة برمجة جينية. باختصار، يتم عزل الخلايا الدموية المحيطية وحيدات النوى (PBMCs) من عينات الفصد الروتينية ومن ثم تربيتها في عوامل نمو محددة لانتاج الكريات الحمر السكان الخلية السلف التكاثري للغاية وقابلة للبرمجة بشكل ملحوظ. Nonintegrating، البلازميدات episomal nontransmissible معربا عن OCT4، SOX2، KLF4، MYCL، LIN28A، والبروتين p53 دبوس الشعر القصير (SH) RNA هي introduدائرة الهندسة المدنية في الأرومة الحمراء المستمدة عبر nucleofection واحد. Cotransfection من يصبوغ التي تعبر عن تعزيز البروتين الفلوري الأخضر (EGFP) يسمح لسهولة تحديد الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل. يضاف البلازميد-تكرار نقص منفصل معربا عن ابشتاين بار مستضد النووي (1 EBNA1) أيضا إلى خليط التفاعل لزيادة التعبير عن البروتينات episomal. ثم يتم مطلي الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل على طبقة من الخلايا الليفية الفأر الجنينية المشع (iMEFs) لاستمرار إعادة برمجة. حالما تظهر المستعمرات IPSC تشبه في حوالي اثني عشر يوما بعد nucleofection، يتم إضافة مثبطات HDAC إلى المتوسطة لتسهيل إعادة جينية. وقد وجدنا أن إدراج مثبطات HDAC يزيد بشكل روتيني الجيل المستعمرات IPSC برمجتها بالكامل بنسبة 2 أضعاف. مرة واحدة المستعمرات IPSC المعرض نموذجي الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (HESC) التشكل، يتم نقلها برفق لiMEF الفردية المغلفة لوحات زراعة الأنسجة لاستمرار النمو والتوسع.
Introduction
وتستمد iPSCs من الأنسجة الجسمية عن طريق التعبير خارج الرحم من مجموعة صغيرة من جينات تعدد القدرات. وقد تجلى هذا الأسلوب في البداية من قبل تنبيغ فيروسات من الخلايا الليفية الإنسان مع OCT4، SOX2، KLF4، وcMYC، التي يتم التعبير عنها بشكل كبير في الدولة المحفزة 1. أعرب عابر هذه "عوامل إعادة برمجة" يغير المشهد جينية والجينات الشخصية التعبير الخلية المستهدفة مماثلة للخلايا الجذعية الجنينية البشرية 2. مرة واحدة تم إنشاؤها، iPSCs يحتمل أن تكون متباينة في أي نوع الأنسجة لمزيد من التحقيق. وبالتالي، فإنها تبشر لاستخدامها في الطب التجديدي، والنمذجة المرض، وتطبيقات العلاج الجيني. ومع ذلك، وتعطيل الجينات مع فيروسات دمج لديه القدرة على تغيير الجينات الذاتية، تأثير النمط الظاهري الخلوية، والتحيز في نهاية المطاف النتائج العلمية. وعلاوة على ذلك، يمكن أن التكامل الفيروسية عشوائية تؤدي إلى البريد الخلوية ضارأثر بعض، بما في ذلك إمكانية التحول الخبيث 3 أو إعادة التعبير عن الجينات المحورة أنكجنيك 4. سوف التطبيقات السريرية في المستقبل يتطلب دمج الجيل غير IPSC.
Episomes، والتي هي خارج الكروموسومات دائري جزيئات الحمض النووي، وتقدم استراتيجية لتوليد فعالة من حيث التكلفة، وخالية من التكامل iPSCs 5. مزيج من ناقلات episomal هو مبين في الجدول 1 التعبير عن عوامل إعادة برمجة OCT4، SOX2، KLF4، MYCL، وLIN28A. يحتوي pCXLE_hOCT3 / 4-shp53-F البلازميد أيضا البروتين p53 shRNA لقمع مؤقت من TP53 لتعزيز إعادة برمجة الخلايا 6. تكرار نقص pCXWB-EBNA1 ناقلات يعزز التضخيم من عوامل إعادة برمجة وإعادة برمجة زيادة الكفاءة من خلال توفير زيادة عابرة في EBNA1 التعبير 7. ويمكن أن يضاف البلازميد pCXLE_EGFP إلى خليط nucleofection لغرض DETErmining كفاءة ترنسفكأيشن أو لتطبيقات الخلايا الفرز. باستثناء ص CXWB-EBNA1، البلازميدات episomal المستخدمة في هذا البروتوكول تتضمن أصل فيروس ابشتاين بار من تكاثر الفيروس وEBNA1 الجين، الذي توسط التكرار وتقسيم يصبوغ أثناء انقسام الخلية المضيفة 8. يتم فقدان episomes تلقائيا مع التوسع التوالي IPSC 7. استنساخ فرعي وتوصيف iPSCs مع episomal فقدان ناقلات، والتي يمكن استنتاجها من فقدان EGFP التعبير، يمكن أن يؤدي إلى التكامل iPSCs خالية تماما للتطبيقات السريرية في المستقبل.
ملازمة لعملية توليد IPSC هو قمع للجينات محددة النسب وتنشيط الجينات المرتبطة تعدد القدرات. تنظيم التعبير الجيني يحدث على مستويات متعددة داخل النواة، بما في ذلك إدخال تعديلات على الحمض النووي والكروماتين للسماح عوامل النسخ، والعناصر التنظيمية DNA، RNA وصول البلمرة لاستهدافالجينات. إعادة تشكيل المشهد جينية عبر تعديلات الكروماتين العالمية عنصرا رئيسيا لإعادة التعبير عن البرنامج الوراثي تعدد القدرات. وهناك تعديل لونين محدد مهم في تنظيم التعبير الجيني هو أستلة من الهستونات خاصة في بقايا يسين، الذي يسمح بالوصول إلى استهداف الجينات من خلال التوتر انخفض لفائف الدنا هيستون. مثبطات HDAC هي عبارة عن جزيئات صغيرة التي ثبت لتعزيز IPSC إعادة برمجة وHESC التجديد الذاتي 9،10، من المحتمل بسبب دعم الدولة الأسيتيل 11. البروتوكول هو موضح أدناه، مقتبسة من منشور مسبق باستخدام lentiviruses دمج 12، يوفر طريقة خطوة بخطوة لتحسين الجيل IPSC من الدم المحيطي باستخدام episomes ومثبطات HDAC. تركيزات مثبط HDAC المستخدمة هنا هي نصف تلك التي وصفها وير، وآخرون. 9، وأدت بشكل روتيني لزيادة بنسبة 2 أضعاف في المستعمرات IPSC إعادة برمجة بالكامل خلال معيارepisomal البروتوكولات دون إعادة برمجة مثبطات HDAC. هذا المستوى من إعادة البرمجة على قدم المساواة مع كفاءة نلاحظ مع أساليب lentiviral. باستخدام هذا البروتوكول، ونحن قد ولدت بكفاءة IPSC من الأفراد قديم 87 سنة من العمر.
Protocol
Representative Results
Discussion
لتوليد IPSC الناجح عند استخدام هذا البروتوكول، وهناك العديد من المحاذير المهمة التي ينبغي النظر فيها. خلال مرحلة التوسع أرومة الحمراء، ينبغي اتباع الجدول الزمني للتغيير وسائل الإعلام بدقة، والانحرافات قد يؤدي إلى تحفيز فعال من السكان خلية سلفية الهدف وكفاءة أقل من ج?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب نود أن نعترف المنح التالية من المعاهد الوطنية للصحة لدعم هذا البحث: K08DK082783 (AR)، P30DK56465 (BTS)، U01HL099993 (BTS)، T32HL00715036 (SKS)، وK12HL0806406 (SKS)؛ ومؤسسة JP مكارثي (AR).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Ficoll-Paque PLUS | Fisher Scientific | 45-001-750 | Store at 4°C. Warm to room temperature before use. |
| DPBS | Life Technologies | 14190-250 | Store at 4°C. |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11875-093 | Store at 4°C. |
| fetal bovine serum (FBS) | Life Technologies | 10437028 | Store at -20°C until needed. Thaw, aliquot, store at 4°C. |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 154938 | Store at room temperature. |
| QBSF-60 serum-free medium | Fisher Scientific | 50-983-234 | Store at 4°C. |
| penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140122 | Store at 4°C. |
| Cell Line Nucleofector Kit V | Lonza | VCA-1003 | Store at 4°C. |
| 2% gelatin solution | Sigma-Aldrich | G1393 | Store at 4°C, liquify in 37°C water bath before use. |
| Hank's Balanced Saline Solution (HBSS) | Life Technologies | 14175-103 | Store at 4°C. |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-092 | Store at 4°C. |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Life Technologies | 12440-061 | Store at 4°C. |
| L-glutamine, 200 mM | Life Technologies | 25030-081 | Aliquot, freeze at -20°C. |
| non-essential amino acids (NEAA), 100X | Life Technologies | 11140-050 | Store at 4°C, away from light. |
| DMEM/Ham's F12, 1:1 | Fisher Scientific | SH30023.02 | Store at 4°C. |
| KnockOut Serum Replacement | Life Technologies | 10828-028 | Aliquot, freeze at -20°C. |
| sodium pyruvate, 100 mM | Life Technologies | 11360-070 | Store at 4°C. |
| sodium bicarbonate, 7.5% | Life Technologies | 25080094 | Store at 4°C. |
| basic fibroblast growth factor (bFGF) | Life Technologies | PHG0263 | Make 10 mg/mL stock in DPBS, aliquot, freeze at -20°C. Once thawed, store at 4°C. |
| sodium butyrate | Sigma-Aldrich | B5887-1G | Make 2000X stock (400 mM) in DPBS, aliquot, freeze at -20°C. Once thawed, store at 4°C. |
| hES Cell Cloning & Recovery Supplement | Stemgent | 01-0014-500 | Store at -20°C until needed. Once thawed, store at 4°C. |
| ESC-qualified BD matrigel | BD Biosciences | 35-4277 | Thaw overnight on ice at 4°C, aliquot into pre-chilled tubes using pre-chilled pipette tips. Store at -20°C until needed. Thaw at 4°C, use immediately. |
| StemSpan SFEM | STEMCELL Technologies | 9650 | Aliquot, freeze at -20°C. |
| ascorbic acid, powdered | Sigma-Aldrich | A4403-100MG | Make 5 mg/mL stock in DPBS, sterile filter, store at 4°C. |
| recombinant human stem cell factor (SCF) | R & D Systems | 255-SC-010 | Make 100 μg/mL stock in SFEM, aliquot, freeze at -20°C. Once thawed, store at 4°C. |
| recombinant human interleukin 3 (IL-3) | R & D Systems | 203-IL-010 | Make 100 μg/mL stock in SFEM, aliquot, freeze at -20°C. Once thawed, store at 4°C. |
| erythropoietin (EPO) | R & D Systems | 287-TC-500 | Make 1000 U/mL stock in SFEM, aliquot, freeze at -20°C. Once thawed, store at 4°C. |
| recombinant human insulin-like growth factor 1 (IGF-1) | R & D Systems | 291-G1-200 | Make 100 μg/mL stock in SFEM, aliquot, freeze at -20°C. Once thawed, store at 4°C. |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522 | Make 1000X stock (100 mM) in DPBS. |
| dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902-25MG | Make 50X stock (50 μM) in DPBS, sterile filter, store at 4°C. |
| SAHA (vorinostat) | Cayman Chemical | 149647-78-9 | Make 2000X stock (400 mM) in DPBS, aliquot, freeze at -20°C. Once thawed, store at 4°C. |
| 12 well tissue culture plate | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| 15 mL conical tube | Sarstedt | 62553002 | |
| 1.5 mL Eppendorf tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 6 well tissue culture plate | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| 35 mm tisue culture plates | BD Biosciences | 353001 | |
| 10 mL disposable serological pipettes | Fisher Scientific | 13-675-20 | |
| 5 mL disposable serological pipettes | Fisher Scientific | 13-675-22 | |
| 2 mL disposable serological pipettes | Fisher Scientific | 13-675-17 | |
| 20 μL pipette tips, barrier tips | Genessee | 24-404 | |
| glass Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| pipette aid | Fisher Scientific | 13-681-15 | |
| pCXLE-hOCT3/4-shp53-F | Addgene | 27077 | |
| pCXLE-hSK | Addgene | 27078 | |
| pCXLE-hUL | Addgene | 27080 | |
| pCXLE-EGFP | Addgene | 27082 | |
| pCXWB-EBNA1 | Addgene | 37624 |
References
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Koche, R. P., et al. Reprogramming factor expression initiates widespread targeted chromatin remodeling. Cell Stem Cell. 8 (1), 96-105 (2011).
- Baum, C., Kustikova, O., Modlich, U., Li, Z., Fehse, B. Mutagenesis and oncogenesis by chromosomal insertion of gene transfer vectors. Human Gene Therapy. 17 (3), 253-263 (2006).
- Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448 (7151), 313-317 (2007).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324 (5928), 797-801 (2009).
- Hong, H., et al. Suppression of induced pluripotent stem cell generation by the p53-p21 pathway. Nature. 460 (7259), 1132-1135 (2009).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
- Yates, J. L., Warren, N., Sugden, B. Stable replication of plasmids derived from Epstein-Barr virus in various mammalian cells. Nature. 313 (6005), 812-815 (1985).
- Ware, C. B., et al. Histone deacetylase inhibition elicits an evolutionarily conserved self-renewal program in embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 4 (4), 359-369 (2009).
- Mali, P., et al. Butyrate greatly enhances derivation of human induced pluripotent stem cells by promoting epigenetic remodeling and the expression of pluripotency-associated genes. Stem Cells. 28 (4), 713-720 (2010).
- Azuara, V., et al. Chromatin signatures of pluripotent cell lines. Nature Cell Biology. 8 (5), 532-538 (2006).
- Sommer, A. G., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using the STEMCCA lentiviral vector. J. Vis. Exp. (68), e4327 (2012).
- Yoshida, Y., Takahashi, K., Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Hypoxia enhances the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 5, 237-241 (2009).
- Abbondanzo, S. J., Gadi, I., Stewart, C. L. Derivation of Embryonic Stem Cell Lines. Methods in Enzymology. 225, 803-823 (1993).
- Kim, H. J., Bae, S. C. Histone deacetylase inhibitors: molecular mechanisms of action and clinical trials as anti-cancer drugs. American Journal of Translational Research. 3 (2), 166-179 (2011).
