Eficiente iPS Generación Celular de sangre usando episomas y HDAC inhibidores

Summary

Aquí se describe un protocolo para la generación de células madre pluripotentes inducidas humanas a partir de sangre periférica mediante una estrategia basada en la reprogramación episoma y los inhibidores de la histona deacetilasa.

Abstract

Este manuscrito ilustra un protocolo para la creación de células de manera eficiente a la integración libre inducidos por el hombre madre pluripotentes (iPSCs) a partir de sangre periférica utilizando plásmidos episomales e inhibidores de la histona deacetilasa (HDAC). Las ventajas de este enfoque incluyen: (1) el uso de una cantidad mínima de sangre periférica como un material de origen; (2) nonintegrating vectores de reprogramación; (3) un método rentable para la generación de vectores iPSCs libres; (4) una sola transfección; y (5) el uso de pequeñas moléculas para facilitar la reprogramación epigenética. Brevemente, las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) se aislaron a partir de muestras de flebotomía de rutina y después se cultivaron en factores de crecimiento definidas para producir una población de células progenitoras de eritrocitos altamente proliferativa que es notablemente susceptibles de reprogramación. Nonintegrating, plásmidos episomales no transmisibles que expresan Oct4, Sox2, KLF4, MYCL, LIN28A, y un corto horquilla (sh) ARN p53 son introduced en los eritroblastos derivados través de un único nucleofection. La cotransfección de un episoma que expresa la proteína fluorescente verde mejorada (EGFP) permite una fácil identificación de las células transfectadas. Un plásmido de replicación deficiente separada expresar Epstein-Barr antígeno nuclear 1 (EBNA1) también se añade a la mezcla de reacción para aumentar la expresión de proteínas episomales. Las células transfectadas se sembraron sobre una capa de fibroblastos de embriones de ratón irradiados (iMEFs) para continuar la reprogramación. Tan pronto como colonias IPSC-como aparecen en aproximadamente doce días después de nucleofection, se añaden inhibidores de HDAC al medio para facilitar la remodelación epigenética. Hemos encontrado que la inclusión de los inhibidores de HDAC aumenta habitualmente la generación de colonias IPSC totalmente reprogramadas por 2 veces. Una vez que las colonias IPSC presentan la morfología típica de células madre embrionarias humanas (CMEH), se transfieren suavemente para placas de cultivo individuales recubiertos de tejido IMEF para el continuo crecimiento y expansión.

Introduction

iPSCs se derivan de tejidos somáticos a través de la expresión ectópica de un conjunto mínimo de genes pluripotencia. Esta técnica se demostró inicialmente por la transducción retroviral de los fibroblastos humanos con Oct4, Sox2, Klf4, y cMYC, que son altamente expresado en el estado pluripotente ^1. Estos transitoriamente expresadas "factores de reprogramación" alteran el perfil de expresión génica y epigenética paisaje de la célula diana análoga a las células madre de embriones humanos ^2. Una vez creado, iPSCs potencialmente puede diferenciarse en cualquier tipo de tejido para análisis adicionales. Por lo tanto, mantienen la promesa para el uso en la medicina regenerativa, el modelado de la enfermedad, y aplicaciones de terapia génica. Sin embargo, lo que altera el genoma con virus que se integran tiene el potencial de alterar la expresión del gen endógeno, la influencia fenotipo celular, y en última instancia sesgan los resultados científicos. Además, integraciones virales aleatorias pueden conducir a celular e deletéreofectos, incluyendo la posibilidad de la transformación maligna ³ o re-expresión de los transgenes oncogénicos ^4. Aplicaciones clínicas futuras requerirán-integración no generación de IPSC.

Episomas, que son moléculas de ADN circular cromosómicas adicionales, ofrecen una estrategia para generar, CMPI-integración libre de costo efectivo ^5. La combinación de vectores episomales que se muestran en la Tabla 1 expresa la reprogramación factores de Oct4, Sox2, Klf4, MYCL, y LIN28A. El plásmido pCXLE_hOCT3 / 4-F-shp53 también contiene una p53 shRNA para la supresión temporal de TP53 para mejorar la reprogramación celular ^6. El vector deficiente pCXWB-EBNA1 replicación promueve la amplificación de factores de reprogramación y el aumento de la eficiencia de reprogramación proporcionando un aumento transitorio en la expresión de EBNA1 ^7. El plásmido pCXLE_EGFP se puede añadir a la mezcla de nucleofection con el propósito de determining la eficacia de transfección o para aplicaciones de células de clasificación. Con la excepción de p CXWB-EBNA1, los plásmidos episomales utilizados en este protocolo contienen el origen del virus de Epstein-Barr de la replicación viral y el gen EBNA1, que median la replicación y la partición del episoma durante la división de la célula huésped ^8. Los episomas se pierden espontáneamente con la expansión sucesiva IPSC ^7. Subclonación y caracterización de iPSCs con pérdida vector episomal, que se puede inferir a partir de la pérdida de la expresión de eGFP, pueden conducir a la integración completamente iPSCs gratuitas para futuras aplicaciones clínicas.

Inherente al proceso de generación de IPSC es la supresión de genes específicos de linaje y la reactivación de los genes de pluripotencia asociada. Regulación de la expresión del gen se produce en múltiples niveles dentro del núcleo, incluyendo modificaciones en el ADN y la cromatina para permitir que factores de transcripción, elementos de ADN reguladores, y el acceso de la ARN polimerasa para orientargenes. Remodelación del paisaje epigenético de la cromatina a través de modificaciones globales es un componente clave para la re-expresión del programa genético pluripotencia. Una modificación de la cromatina específica que es importante en la regulación de la expresión génica es la acetilación de las histonas en particular los residuos de lisina, que permite el acceso a genes diana a través de disminución de la tensión de la bobina de ADN-histona. Inhibidores de HDAC son pequeñas moléculas que se han demostrado para mejorar IPSC reprogramación y células madre auto-renovación ^9,10, probablemente debido al apoyo del estado acetilado ^11. El protocolo se describe a continuación, adaptada de una publicación anterior utilizando la integración de los lentivirus ^12, proporciona un método paso a paso para la generación de IPSC optimizado a partir de sangre periférica utilizando episomas y los inhibidores de HDAC. Las concentraciones de inhibidor de HDAC utilizados aquí son la mitad de los descritos por Ware, y otros han llevado habitualmente a un aumento de 2 veces en colonias IPSC totalmente reprogramadas más estándar. ^9, yprotocolos de reprogramación episomales sin inhibidores de HDAC. Este nivel de reprogramación es a la par con la eficiencia que observamos con métodos de lentivirus. El uso de este protocolo, se han generado de manera eficiente IPSC de individuos como viejos como 87 años de edad.

Protocol

Consentimiento informado por escrito, según lo aprobado por las juntas de revisión institucional del Centro de Investigación del Cáncer Fred Hutchinson y los niños "s Hospital of Philadelphia, se obtuvo de los pacientes antes de la recogida de muestras de sangre periférica. Se observaron Todas las directrices institucionales. Todos los experimentos con animales, incluyendo la generación de MEF y formación de teratomas fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional. <p class="…

Representative Results

Tres días después de nucleofection y de las placas, las células nucleofected en iMEFs, la eficiencia de nucleofection exitoso debe ser estimado por microscopía de fluorescencia para eGFP. La Figura 1 muestra un experimento de nucleofection típico con aproximadamente 5-10% de la población total de células que expresan eGFP. Colonias reprogramado IPSC comenzarán a aparecer aproximadamente dos semanas después de nucleofection. Las colonias son generalmente circular con…

Discussion

Para exitosa generación de IPSC cuando se utiliza este protocolo, hay varias advertencias importantes que deben ser considerados. Durante la fase de expansión eritroblasto, el programa de cambio de los medios de comunicación debe ser estrictamente seguida, como desviaciones pueden conducir a la estimulación ineficiente de la población de células progenitoras diana y una menor eficiencia de la generación de IPSC. Es importante hacer nuevo medio de expansión con dexametasona fresca con cada cambio de los medios de…

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Ficoll-Paque PLUS	Fisher Scientific	45-001-750	Store at 4°C. Warm to room temperature before use.
DPBS	Life Technologies	14190-250	Store at 4°C.
RPMI 1640	Life Technologies	11875-093	Store at 4°C.
fetal bovine serum (FBS)	Life Technologies	10437028	Store at -20°C until needed. Thaw, aliquot, store at 4°C.
dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	154938	Store at room temperature.
QBSF-60 serum-free medium	Fisher Scientific	50-983-234	Store at 4°C.
penicillin/streptomycin	Life Technologies	15140122	Store at 4°C.
Cell Line Nucleofector Kit V	Lonza	VCA-1003	Store at 4°C.
2% gelatin solution	Sigma-Aldrich	G1393	Store at 4°C, liquify in 37°C water bath before use.
Hank's Balanced Saline Solution (HBSS)	Life Technologies	14175-103	Store at 4°C.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Life Technologies	11965-092	Store at 4°C.
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)	Life Technologies	12440-061	Store at 4°C.
L-glutamine, 200 mM	Life Technologies	25030-081	Aliquot, freeze at -20°C.
non-essential amino acids (NEAA), 100X	Life Technologies	11140-050	Store at 4°C, away from light.
DMEM/Ham's F12, 1:1	Fisher Scientific	SH30023.02	Store at 4°C.
KnockOut Serum Replacement	Life Technologies	10828-028	Aliquot, freeze at -20°C.
sodium pyruvate, 100 mM	Life Technologies	11360-070	Store at 4°C.
sodium bicarbonate, 7.5%	Life Technologies	25080094	Store at 4°C.
basic fibroblast growth factor (bFGF)	Life Technologies	PHG0263	Make 10 mg/mL stock in DPBS, aliquot, freeze at -20°C. Once thawed, store at 4°C.
sodium butyrate	Sigma-Aldrich	B5887-1G	Make 2000X stock (400 mM) in DPBS, aliquot, freeze at -20°C. Once thawed, store at 4°C.
hES Cell Cloning & Recovery Supplement	Stemgent	01-0014-500	Store at -20°C until needed. Once thawed, store at 4°C.
ESC-qualified BD matrigel	BD Biosciences	35-4277	Thaw overnight on ice at 4°C, aliquot into pre-chilled tubes using pre-chilled pipette tips. Store at -20°C until needed. Thaw at 4°C, use immediately.
StemSpan SFEM	STEMCELL Technologies	9650	Aliquot, freeze at -20°C.
ascorbic acid, powdered	Sigma-Aldrich	A4403-100MG	Make 5 mg/mL stock in DPBS, sterile filter, store at 4°C.
recombinant human stem cell factor (SCF)	R & D Systems	255-SC-010	Make 100 μg/mL stock in SFEM, aliquot, freeze at -20°C. Once thawed, store at 4°C.
recombinant human interleukin 3 (IL-3)	R & D Systems	203-IL-010	Make 100 μg/mL stock in SFEM, aliquot, freeze at -20°C. Once thawed, store at 4°C.
erythropoietin (EPO)	R & D Systems	287-TC-500	Make 1000 U/mL stock in SFEM, aliquot, freeze at -20°C. Once thawed, store at 4°C.
recombinant human insulin-like growth factor 1 (IGF-1)	R & D Systems	291-G1-200	Make 100 μg/mL stock in SFEM, aliquot, freeze at -20°C. Once thawed, store at 4°C.
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M7522	Make 1000X stock (100 mM) in DPBS.
dexamethasone	Sigma-Aldrich	D4902-25MG	Make 50X stock (50 μM) in DPBS, sterile filter, store at 4°C.
SAHA (vorinostat)	Cayman Chemical	149647-78-9	Make 2000X stock (400 mM) in DPBS, aliquot, freeze at -20°C. Once thawed, store at 4°C.
12 well tissue culture plate	Fisher Scientific	08-772-29
15 mL conical tube	Sarstedt	62553002
1.5 mL Eppendorf tube	Fisher Scientific	05-408-129
6 well tissue culture plate	Fisher Scientific	08-772-1B
35 mm tisue culture plates	BD Biosciences	353001
10 mL disposable serological pipettes	Fisher Scientific	13-675-20
5 mL disposable serological pipettes	Fisher Scientific	13-675-22
2 mL disposable serological pipettes	Fisher Scientific	13-675-17
20 μL pipette tips, barrier tips	Genessee	24-404
glass Pasteur pipettes	Fisher Scientific	13-678-20D
pipette aid	Fisher Scientific	13-681-15
pCXLE-hOCT3/4-shp53-F	Addgene	27077
pCXLE-hSK	Addgene	27078
pCXLE-hUL	Addgene	27080
pCXLE-EGFP	Addgene	27082
pCXWB-EBNA1	Addgene	37624