ここでは、再プログラミング戦略とヒストンデアセチラーゼ阻害剤ベースのエピソームを用いて末梢血からのヒト人工多能性幹細胞を生成するためのプロトコルを記述している。
この原稿を効率的にエピソームプラスミドおよびヒストンデアセチラーゼ(HDAC)阻害剤を用いて末梢血からの統合を含まないヒト誘導多能性幹細胞(iPS細胞)を作成するためのプロトコルを示す。このアプローチの利点は、(1)原料として、末梢血の最小量の使用。 (2)リプログラミングベクター非統合。 (3)ベクトルフリー性IPSCを生成するための費用効果的な方法。 (4)シングルトランスフェクション。 (5)小分子の使用は、エピジェネティックな再プログラミングを容易にする。簡単に述べると、末梢血単核細胞(PBMC)ルーチン瀉血サンプルから単離し、次いで、再プログラミングに著しく適している、高度に増殖性の赤血球前駆細胞集団を得た定義された成長因子の中で培養される。非統合、OCT4、SOX2、KLF4、MYCL、LIN28A、およびp53の短いヘアピン(SH)RNAを発現する非伝播エピソームのプラスミドはintroduですシングルクレオによって派生赤芽球へのced。強化された緑色蛍光タンパク質(EGFP)を発現するエピソームの同時トランスフェクションは、トランスフェクションされた細胞の容易な同定を可能にする。エプスタイン-バー核抗原1(EBNA1)を発現する独立した複製欠損プラスミドはまた、エピソームのタンパク質の増大した発現のための反応混合物に添加される。トランスフェクションされた細胞は、その後の継続的再プログラミングのために照射したマウス胚性線維芽細胞(iMEFs)の層上にメッキされている。否やIPSC様コロニーはヌクレオ後約12日目に現れるように、HDAC阻害剤は、エピジェネティックなリモデリングを促進するために培地に添加される。我々は、HDAC阻害剤を含めることが日常的に2倍にすることによって完全に再プログラムIPSCコロニーの生成を増加させることを見出した。 IPSCのコロニーは典型的なヒト胚性幹細胞(hESCの)形態を示したら、それらを穏やかに継続的な成長および増殖のための個々のiMEFコーティングした組織培養プレートに移す。
iPS細胞は、多能性遺伝子の最小限のセットの異所性発現を介して細胞組織から誘導される。この技術は、最初に非常に多能性状態1で表現されるOCT4、SOX2、KLF4、およびcMYCはヒト線維芽細胞のレトロウイルス形質導入によって実証された。これらの一時的に発現「再プログラミング因子」は、ヒト胚性幹細胞2に、標的細胞のエピジェネティックな風景や遺伝子発現プロファイルが類似して変更する。作成後は、性IPSCは、潜在的に、さらなる調査のための任意の組織型に分化させることができる。したがって、それらは、再生医療、疾患モデル、および遺伝子治療用途において使用するための有望。しかし、統合ウイルスのゲノムを破壊することは、内因性遺伝子発現、細胞の表現型の影響を変化させる可能性があり、最終的に科学的な結果にバイアスをかける。さらに、ランダムウイルス統合は有害な携帯電子につながる可能性悪性形質転換3または発癌導入遺伝子4の再発現の可能含めffects、。将来の臨床応用は、非組み込みIPSCの生成が必要になります。
染色体外環状DNA分子であるエピソーム、効果的なコストを発生させるための戦略を提供し、統合のないiPS細胞5。 表1に示したエピソームベクターの組み合わせは、再プログラミングは、OCT4、SOX2、KLF4、MYCL、およびLIN28A因子発現する。 pCXLE_hOCT3 / 4-shp53-Fプラスミドは、細胞リプログラミング6を強化するため、TP53の一時的な抑制のためのp53 shRNAを含まれています。複製欠損pCXWB-EBNA1ベクターは、EBNA1式 7の一過性の増加を提供することで、初期化因子の増幅および増加初期化の効率を促進する。 pCXLE_EGFPプラスミドはDETEの目的のためにヌクレオ混合物に加えることができるトランスフェクション効率をrminingまたはセルソーティングアプリケーションに最適です。 p個のCXWB-EBNA1を除いて、このプロトコルで使用されるエピソームプラスミドは、宿主細胞の分裂8中エピソームの複製およびパーティションを媒介する、ウイルス複製およびEBNA1遺伝子のエプスタイン-バーウイルス起点を含む。エピソームは自然に連続したIPSC拡張7で失われます。サブクローニングおよびeGFP発現の損失から推測できるエピソームベクターの損失を有するiPS細胞の特徴付けは、将来の臨床応用のための完全に統合フリー性IPSCをもたらすことができる。
IPSCの生成のプロセスに固有の系統特異的遺伝子および多能性関連遺伝子の再活性化の抑制である。遺伝子発現の調節は、転写因子、調節DNAエレメント、およびRNAポリメラーゼのアクセスが対象とすることを可能にするDNAとクロマチンの修飾を含む、核内の複数のレベルで生じる遺伝子。グローバルクロマチン修飾を介したエピジェネティックな風景のリモデリングは、多能性遺伝的プログラムの再発現に重要なコンポーネントです。遺伝子発現の調節に重要である特定のクロマチン修飾は、ヒストンDNAコイルの減少緊張を通して遺伝子を標的とするためのアクセスを許可する特定のリジン残基でのヒストンのアセチル化である。 HDAC阻害剤は、アセチル化状態11を支持する可能性が、IPSCの再プログラミングおよびhESCの自己再生9,10を増強することが示されている小分子である。統合レンチ12を用いて、公開前から適合以下に記載されるプロトコルは、エピソームおよびHDAC阻害剤を用いて、末梢血から最適化IPSCを生成するためのステップバイステップの方法を提供する。ここで使用されるHDAC阻害剤の濃度は、ウェアによって記載されたものの半分であるら 9、日常標準にわたって完全に再プログラムIPSCコロニーにおける2倍の増加につながっているHDAC阻害剤なしでエピソーム再プログラミングプロトコル。再プログラミングのこのレベルは、我々は、レンチウイルスの方法で観察する効率と同等である。このプロトコルを用いて、効率的に年齢87歳と同じくらい古い個人からのIPSCを生成した。
このプロトコルを使用するときに成功したIPSCの生成のために、考慮すべきいくつかの重要な注意事項があります。偏差が目標前駆細胞集団の非効率的な刺激およびIPSCの生成の低い効率につながる可能性がある赤芽球の膨張段階で、培地交換スケジュールは厳密に従わなければならない。各培地交換新鮮デキサメタゾンで新しい増殖培地を作ることが重要である。そしてQBSF-60基本培地および?…
The authors have nothing to disclose.
著者は、この研究を支援するため、NIHから次の助成認めることを望む:K08DK082783(AR)、P30DK56465(BTS)、U01HL099993(BTS)、T32HL00715036(SKS)、およびK12HL0806406(SKS)を。とJPマッカーシー財団(AR)。
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Ficoll-Paque PLUS | Fisher Scientific | 45-001-750 | Store at 4°C. Warm to room temperature before use. |
DPBS | Life Technologies | 14190-250 | Store at 4°C. |
RPMI 1640 | Life Technologies | 11875-093 | Store at 4°C. |
fetal bovine serum (FBS) | Life Technologies | 10437028 | Store at -20°C until needed. Thaw, aliquot, store at 4°C. |
dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 154938 | Store at room temperature. |
QBSF-60 serum-free medium | Fisher Scientific | 50-983-234 | Store at 4°C. |
penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140122 | Store at 4°C. |
Cell Line Nucleofector Kit V | Lonza | VCA-1003 | Store at 4°C. |
2% gelatin solution | Sigma-Aldrich | G1393 | Store at 4°C, liquify in 37°C water bath before use. |
Hank's Balanced Saline Solution (HBSS) | Life Technologies | 14175-103 | Store at 4°C. |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-092 | Store at 4°C. |
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Life Technologies | 12440-061 | Store at 4°C. |
L-glutamine, 200 mM | Life Technologies | 25030-081 | Aliquot, freeze at -20°C. |
non-essential amino acids (NEAA), 100X | Life Technologies | 11140-050 | Store at 4°C, away from light. |
DMEM/Ham's F12, 1:1 | Fisher Scientific | SH30023.02 | Store at 4°C. |
KnockOut Serum Replacement | Life Technologies | 10828-028 | Aliquot, freeze at -20°C. |
sodium pyruvate, 100 mM | Life Technologies | 11360-070 | Store at 4°C. |
sodium bicarbonate, 7.5% | Life Technologies | 25080094 | Store at 4°C. |
basic fibroblast growth factor (bFGF) | Life Technologies | PHG0263 | Make 10 mg/mL stock in DPBS, aliquot, freeze at -20°C. Once thawed, store at 4°C. |
sodium butyrate | Sigma-Aldrich | B5887-1G | Make 2000X stock (400 mM) in DPBS, aliquot, freeze at -20°C. Once thawed, store at 4°C. |
hES Cell Cloning & Recovery Supplement | Stemgent | 01-0014-500 | Store at -20°C until needed. Once thawed, store at 4°C. |
ESC-qualified BD matrigel | BD Biosciences | 35-4277 | Thaw overnight on ice at 4°C, aliquot into pre-chilled tubes using pre-chilled pipette tips. Store at -20°C until needed. Thaw at 4°C, use immediately. |
StemSpan SFEM | STEMCELL Technologies | 9650 | Aliquot, freeze at -20°C. |
ascorbic acid, powdered | Sigma-Aldrich | A4403-100MG | Make 5 mg/mL stock in DPBS, sterile filter, store at 4°C. |
recombinant human stem cell factor (SCF) | R & D Systems | 255-SC-010 | Make 100 μg/mL stock in SFEM, aliquot, freeze at -20°C. Once thawed, store at 4°C. |
recombinant human interleukin 3 (IL-3) | R & D Systems | 203-IL-010 | Make 100 μg/mL stock in SFEM, aliquot, freeze at -20°C. Once thawed, store at 4°C. |
erythropoietin (EPO) | R & D Systems | 287-TC-500 | Make 1000 U/mL stock in SFEM, aliquot, freeze at -20°C. Once thawed, store at 4°C. |
recombinant human insulin-like growth factor 1 (IGF-1) | R & D Systems | 291-G1-200 | Make 100 μg/mL stock in SFEM, aliquot, freeze at -20°C. Once thawed, store at 4°C. |
β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522 | Make 1000X stock (100 mM) in DPBS. |
dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902-25MG | Make 50X stock (50 μM) in DPBS, sterile filter, store at 4°C. |
SAHA (vorinostat) | Cayman Chemical | 149647-78-9 | Make 2000X stock (400 mM) in DPBS, aliquot, freeze at -20°C. Once thawed, store at 4°C. |
12 well tissue culture plate | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
15 mL conical tube | Sarstedt | 62553002 | |
1.5 mL Eppendorf tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
6 well tissue culture plate | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
35 mm tisue culture plates | BD Biosciences | 353001 | |
10 mL disposable serological pipettes | Fisher Scientific | 13-675-20 | |
5 mL disposable serological pipettes | Fisher Scientific | 13-675-22 | |
2 mL disposable serological pipettes | Fisher Scientific | 13-675-17 | |
20 μL pipette tips, barrier tips | Genessee | 24-404 | |
glass Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
pipette aid | Fisher Scientific | 13-681-15 | |
pCXLE-hOCT3/4-shp53-F | Addgene | 27077 | |
pCXLE-hSK | Addgene | 27078 | |
pCXLE-hUL | Addgene | 27080 | |
pCXLE-EGFP | Addgene | 27082 | |
pCXWB-EBNA1 | Addgene | 37624 |