Efficace sur les Cellules iPS génération de sang à l'aide qu'épisomes et les inhibiteurs de HDAC

Summary

Nous décrivons ici un protocole pour générer des cellules souches pluripotentes induites humaines du sang périphérique en utilisant une stratégie de reprogrammation de episome base et les inhibiteurs d'histone déacétylase.

Abstract

Ce manuscrit illustre un protocole pour créer efficacement des cellules gratuit intégration humains souches pluripotentes induites (CISP) du sang périphérique en utilisant des plasmides épisomiques et histone déacétylase (HDAC) inhibiteurs. Les avantages de cette approche sont les suivants: (1) l'utilisation d'une quantité minimale de sang périphérique en tant que matériau de source; (2) nonintegrating vecteurs de reprogrammation; (3) une méthode rentable pour générer des vecteurs iPSCs libres; (4) une seule transfection; et (5) l'utilisation de petites molécules pour faciliter la reprogrammation épigénétique. En bref, des cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) sont isolées à partir d'échantillons de phlébotomie routine et ensuite mises en culture dans des facteurs de croissance définies pour obtenir une population de cellules progénitrices érythrocytaires hautement proliférative qui est remarquablement prêtent à une reprogrammation. Nonintegrating, plasmides épisomiques non transmissibles exprimant OCT4, SOX2, KLF4, MYCL, LIN28A, et un court en épingle à cheveux (sh) ARN p53 sont introduced dans les érythroblastes dérivés via une seule nucléofection. La co-transfection d'un épisome qui exprime renforcée protéine fluorescente verte (eGFP) permet une identification facile des cellules transfectées. Un plasmide à réplication déficiente séparé d'Epstein-Barr exprimant l'antigène nucléaire 1 (EBNA1) est également ajouté au mélange réactionnel pour une expression accrue de protéines de épisomiques. Les cellules transfectées sont ensuite étalées sur une couche de fibroblastes embryonnaires de souris irradiées (les iMEFs) pour une reprogrammation continue. Dès que des colonies apparaissent comme iPSC à environ douze jours après nucléofection, les inhibiteurs de HDAC sont ajoutés au milieu pour faciliter le remodelage épigénétique. Nous avons trouvé que l'inclusion d'inhibiteurs HDAC augmente régulièrement la génération de colonies iPSC entièrement reprogrammé par 2 fois. Une fois colonies iPSC présentent typique cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) morphologie, ils sont délicatement transférés à Imef tissus enduits des plaques de culture individuels pour la croissance et l'expansion continue.

Introduction

iPSCs sont dérivées de tissus somatiques par l'expression ectopique d'un ensemble minimal de gènes de pluripotence. Cette technique a d'abord été démontré par transduction rétrovirale des fibroblastes humains avec OCT4, SOX2, KLF4, et cmyc, qui sont fortement exprimés dans l'état pluripotent ^1. Ces exprimés de façon transitoire "facteurs de reprogrammation épigénétique" modifient le paysage et profil d'expression génique de la cellule cible analogue aux cellules souches embryonnaires humaines ^2. Une fois créé, iPSCs peut potentiellement être différenciées en tout type de tissu pour complément d'enquête. Ainsi, ils sont prometteurs pour l'utilisation dans la médecine régénérative, la modélisation des maladies, et des applications de thérapie génique. Cependant, ce qui perturbe le génome des virus intégrant a le potentiel de modifier l'expression du gène endogène, influence le phénotype cellulaire, et en fin de compte de biaiser les résultats scientifiques. En outre, les intégrations virales aléatoires peuvent conduire à délétère e cellulaireffets, y compris la possibilité d'une transformation maligne ³ ou ré-expression des transgènes oncogènes ^4. Futures applications cliniques, il faudra intégrer les non-génération iPSC.

Qu'épisomes, qui sont chromosomiques circulaire molécules d'ADN supplémentaires, offrent une stratégie visant à générer iPSCs rentables, sans ^{intégration-5.} La combinaison de vecteurs épisomiques indiqués dans le tableau 1 expriment la reprogrammation facteurs OCT4, SOX2, KLF4, MYCL, et LIN28A. Le plasmide pCXLE_hOCT3 / 4-shp53-F contient également une p53 shRNA pour la suppression temporaire de TP53 à améliorer la reprogrammation cellulaire ^6. Le déficient vecteur pCXWB-EBNA1 réplication favorise l'amplification des facteurs de reprogrammation et une efficacité accrue de reprogrammation en fournissant une augmentation transitoire de l'expression de EBNA1 ^7. Le plasmide pCXLE_EGFP peut être ajouté au mélange de nucléofection dans le but de determining l'efficacité de transfection ou pour des applications de tri des cellules. A l'exception du p-EBNA1 CXWB, des plasmides épisomiques utilisées dans ce protocole contiennent l'origine du virus d'Epstein-Barr de la réplication du virus et le gène EBNA1, qui médient la réplication et la partition de l'épisome au cours de la division de la cellule hôte ^8. Les qu'épisomes sont spontanément perdu avec extensions successives iPSC ^7. Sous-clonage et la caractérisation des CSPi avec épisomaux perte de vecteur, qui peut être déduit de la perte d'expression eGFP, peuvent conduire à l'intégration complètement iPSCs gratuits pour futures applications cliniques.

Inhérente au processus de génération iPSC est la suppression de gènes spécifiques de la lignée et la réactivation des gènes de pluripotence associée. Régulation de l'expression des gènes se produit à plusieurs niveaux dans le noyau, y compris les modifications de l'ADN et la chromatine pour permettre des facteurs de transcription, des éléments d'ADN régulatrices, et l'accès de l'ARN polymérase à ciblergènes. Rénovation du paysage épigénétique via des modifications globales de la chromatine est un élément clé de ré-expression du programme génétique de la pluripotence. Une modification de la chromatine spécifique qui est importante dans la régulation de l'expression génique est l'acétylation des histones particulier à des résidus lysine, permettant l'accès à cibler des gènes par le biais diminution de la tension de la bobine d'histone-ADN. Les inhibiteurs de HDAC sont de petites molécules qui ont été montré pour améliorer la reprogrammation de cellules iPSC et CSEh auto-renouvellement ^9,10, probablement en raison de l'appui de l'état acétylé ^11. Le protocole décrit ci-dessous, adapté d'une publication préalable en utilisant des lentivirus intégrant ^12, fournit une méthode étape par étape pour la production de cellules iPSC optimisé de sang périphérique en utilisant qu'épisomes et les inhibiteurs d'HDAC. Les concentrations d'inhibiteur d'HDAC utilisés ici sont la moitié de ceux décrits par Ware, et al. ^9, et ont systématiquement conduit à une augmentation de 2 fois dans les colonies iPSC entièrement reprogrammés plus de normeprotocoles de reprogrammation épisomaux sans inhibiteurs d'HDAC. Ce niveau de reprogrammation va de pair avec l'efficacité que nous observons avec les méthodes lentiviraux. En utilisant ce protocole, nous avons généré efficacement iPSC de personnes comme vieux de 87 ans.

Protocol

Le consentement éclairé, tel qu'approuvé par les Institutional Review Board de la Cancer Research Center Fred Hutchinson et de l'hôpital de Philadelphie s enfants », a été obtenu à partir de patients avant de recueillir des échantillons de sang périphérique. Toutes les lignes directrices institutionnelles ont été observées. Toutes les expériences animales, y compris la génération MEF et formation de tératome ont été approuvés par le Comité de protection des animaux et institutionnel. <p…

Representative Results

Trois jours après nucléofection et avant l'étalement des cellules sur nucleofected iMEFs, l'efficacité de nucléofection réussi doit être estimée par microscopie à fluorescence pour eGFP. La figure 1 représente une expérience typique de nucléofection à environ 5-10% de la population totale des cellules exprimant eGFP. Colonies reprogrammées iPSC vont commencer à apparaître environ deux semaines après nucléofection. Les colonies sont généralement ci…

Discussion

Pour la réussite génération iPSC lors de l'utilisation de ce protocole, il ya plusieurs mises en garde importantes qui devraient être considérés. Au cours de la phase d'expansion des érythroblastes, le calendrier de changement de support doit être strictement suivie, que les écarts peuvent conduire à la stimulation inefficace de la population de cellules progénitrices cible et un rendement plus faible de génération iPSC. Il est important de faire de nouveaux milieu d'expansion avec la dexamétha…

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Ficoll-Paque PLUS	Fisher Scientific	45-001-750	Store at 4°C. Warm to room temperature before use.
DPBS	Life Technologies	14190-250	Store at 4°C.
RPMI 1640	Life Technologies	11875-093	Store at 4°C.
fetal bovine serum (FBS)	Life Technologies	10437028	Store at -20°C until needed. Thaw, aliquot, store at 4°C.
dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	154938	Store at room temperature.
QBSF-60 serum-free medium	Fisher Scientific	50-983-234	Store at 4°C.
penicillin/streptomycin	Life Technologies	15140122	Store at 4°C.
Cell Line Nucleofector Kit V	Lonza	VCA-1003	Store at 4°C.
2% gelatin solution	Sigma-Aldrich	G1393	Store at 4°C, liquify in 37°C water bath before use.
Hank's Balanced Saline Solution (HBSS)	Life Technologies	14175-103	Store at 4°C.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Life Technologies	11965-092	Store at 4°C.
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)	Life Technologies	12440-061	Store at 4°C.
L-glutamine, 200 mM	Life Technologies	25030-081	Aliquot, freeze at -20°C.
non-essential amino acids (NEAA), 100X	Life Technologies	11140-050	Store at 4°C, away from light.
DMEM/Ham's F12, 1:1	Fisher Scientific	SH30023.02	Store at 4°C.
KnockOut Serum Replacement	Life Technologies	10828-028	Aliquot, freeze at -20°C.
sodium pyruvate, 100 mM	Life Technologies	11360-070	Store at 4°C.
sodium bicarbonate, 7.5%	Life Technologies	25080094	Store at 4°C.
basic fibroblast growth factor (bFGF)	Life Technologies	PHG0263	Make 10 mg/mL stock in DPBS, aliquot, freeze at -20°C. Once thawed, store at 4°C.
sodium butyrate	Sigma-Aldrich	B5887-1G	Make 2000X stock (400 mM) in DPBS, aliquot, freeze at -20°C. Once thawed, store at 4°C.
hES Cell Cloning & Recovery Supplement	Stemgent	01-0014-500	Store at -20°C until needed. Once thawed, store at 4°C.
ESC-qualified BD matrigel	BD Biosciences	35-4277	Thaw overnight on ice at 4°C, aliquot into pre-chilled tubes using pre-chilled pipette tips. Store at -20°C until needed. Thaw at 4°C, use immediately.
StemSpan SFEM	STEMCELL Technologies	9650	Aliquot, freeze at -20°C.
ascorbic acid, powdered	Sigma-Aldrich	A4403-100MG	Make 5 mg/mL stock in DPBS, sterile filter, store at 4°C.
recombinant human stem cell factor (SCF)	R & D Systems	255-SC-010	Make 100 μg/mL stock in SFEM, aliquot, freeze at -20°C. Once thawed, store at 4°C.
recombinant human interleukin 3 (IL-3)	R & D Systems	203-IL-010	Make 100 μg/mL stock in SFEM, aliquot, freeze at -20°C. Once thawed, store at 4°C.
erythropoietin (EPO)	R & D Systems	287-TC-500	Make 1000 U/mL stock in SFEM, aliquot, freeze at -20°C. Once thawed, store at 4°C.
recombinant human insulin-like growth factor 1 (IGF-1)	R & D Systems	291-G1-200	Make 100 μg/mL stock in SFEM, aliquot, freeze at -20°C. Once thawed, store at 4°C.
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M7522	Make 1000X stock (100 mM) in DPBS.
dexamethasone	Sigma-Aldrich	D4902-25MG	Make 50X stock (50 μM) in DPBS, sterile filter, store at 4°C.
SAHA (vorinostat)	Cayman Chemical	149647-78-9	Make 2000X stock (400 mM) in DPBS, aliquot, freeze at -20°C. Once thawed, store at 4°C.
12 well tissue culture plate	Fisher Scientific	08-772-29
15 mL conical tube	Sarstedt	62553002
1.5 mL Eppendorf tube	Fisher Scientific	05-408-129
6 well tissue culture plate	Fisher Scientific	08-772-1B
35 mm tisue culture plates	BD Biosciences	353001
10 mL disposable serological pipettes	Fisher Scientific	13-675-20
5 mL disposable serological pipettes	Fisher Scientific	13-675-22
2 mL disposable serological pipettes	Fisher Scientific	13-675-17
20 μL pipette tips, barrier tips	Genessee	24-404
glass Pasteur pipettes	Fisher Scientific	13-678-20D
pipette aid	Fisher Scientific	13-681-15
pCXLE-hOCT3/4-shp53-F	Addgene	27077
pCXLE-hSK	Addgene	27078
pCXLE-hUL	Addgene	27080
pCXLE-EGFP	Addgene	27082
pCXWB-EBNA1	Addgene	37624