Эффективное плюрипотентных клеток поколения от крови Использование эписом и HDAC ингибиторов
Summary
Здесь мы опишем протокол для создания человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток из периферической крови с использованием стратегии перепрограммирования эписомы основе и ингибиторы гистондеацетилазы.
Abstract
Эта рукопись иллюстрирует протокол для эффективного создания интеграционных свободной человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) из периферической крови с помощью эписомные плазмиды и гистондеацетилазы ингибиторы (HDAC). Преимущества этого подхода включают: (1) использование минимального количества периферической крови в качестве исходного материала; (2) nonintegrating перепрограммирования векторы; (3) экономически эффективным способом для создания векторных бесплатно ИПСК; (4) единый трансфекции; и (5) использование малых молекул, чтобы облегчить эпигенетическую перепрограммирование. Вкратце, мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) изолированы от рутинных проб флеботомии и затем культивировали в определенных факторов роста с получением высокой пролиферативной население эритроцитов клеток-предшественников, которые заметно поддаются перепрограммированию. Nonintegrating, nontransmissible эписомные плазмиды, выражающие OCT4, SOX2, Klf4, MYCL, LIN28A, и p53 короткие шпильки (SH) РНК являются ВведеCED в производные эритробластов с помощью одного nucleofection. Котрансфекции эписомы что выражает повышенной зеленый белок флуоресцентный (EGFP) позволяет легко идентифицировать трансфицированных клеток. Отдельный-дефицитных репликации плазмиды, экспрессирующей Эпштейна-Барр ядерный антиген (1 EBNA1) также добавляют к реакционной смеси в течение повышенной экспрессией белков эписомальные. Трансфицированные клетки затем высевали на слой облученного мышиных эмбриональных фибробластов (iMEFs) для дальнейшего перепрограммирования. Как только IPSC-как колонии появляются примерно в двенадцать дней после nucleofection, ингибиторы ГДАЦ добавляются в среду, чтобы облегчить эпигенетическую ремоделирования. Мы обнаружили, что включение ингибиторов HDAC обычно увеличивает поколение полностью перепрограммировать колоний ИПСК по 2 раза. После IPSC колонии демонстрируют типичную человеческих эмбриональных стволовых клеток (чЭСК) морфологию, они аккуратно перечисляемых на индивидуальные КПКО покрытием тканевых культур пластин для дальнейшего роста и расширения.
Introduction
иПСК получены из соматических тканей с помощью эктопической экспрессии минимальным набором генов плюрипотентности. Этот метод был первоначально продемонстрировано ретровирусной трансдукции фибробластов человека с OCT4, Sox2, Klf4 и CMYC, которые с высоким уровнем экспрессии в плюрипотентное состояние 1. Эти временно выраженные "перепрограммирования факторы" изменить эпигенетические пейзаж и ген профиль экспрессии целевого ячейки аналогично человеческих эмбриональных стволовых клеток 2. После создания иПСК потенциально могут быть дифференцированы в любой тип ткани для дальнейшего расследования. Таким образом, они перспективны для использования в регенеративной медицине, моделирования заболевания, и генной терапии. Однако, нарушая геном с интегрирующих вирусов имеет потенциал, чтобы изменить эндогенной экспрессии генов, клеточного фенотипа влияние, и в конечном итоге предвзятость научные результаты. Кроме того, случайные вирусные интеграция может привести к вредным сотовой еffects, включая возможность злокачественной трансформации 3 или повторного выражения онкогенных трансгенов 4. Будущие клинические приложения потребует неинтегрирующих IPSC поколения.
Эписом, которые лишних хромосом круговой молекулы ДНК, предложить стратегию для создания экономически эффективных, интеграции, свободной ИПСК 5. Сочетание эписомные векторы, показанные в таблице 1, выражают перепрограммирование факторы OCT4, Sox2, Klf4, MYCL и LIN28A. PCXLE_hOCT3 / 4-shp53-F плазмиды также содержит р53 shRNA для временного подавления TP53 повышения клеточного перепрограммирования 6. Репликации вектор с дефицитом pCXWB-EBNA1 способствует усиление факторов перепрограммирования и повышенную эффективность перепрограммирования путем предоставления кратковременное повышение экспрессии EBNA1 7. PCXLE_EGFP плазмида может быть добавлено к смеси nucleofection с целью DETErmining эффективность трансфекции или для приложений сортировки клеток. За исключением р-CXWB EBNA1, что эписомные плазмиды, используемые в этом протоколе содержать вирус происхождение Эпштейна-Барр вирусной репликации и ген EBNA1, которые опосредуют репликацию и разбиение эписома во время деления клетки-хозяина 8. В эписомы спонтанно потерял с расширением последовательных IPSC 7. Субклонирование и характеристика ИПСК с потерей вектора эписомального, которые могут быть выведены из потере экспрессии EGFP, может привести к совершенно интеграции свободных ИПСК для будущих клинических применений.
Присущее процессе генерации IPSC является подавление родословной специфических генов и реактивация плюрипотентности генов, ассоциированных с. Регуляция экспрессии генов происходит на нескольких уровнях внутри ядра, в том числе изменений в ДНК и хроматина в позволяют транскрипционные факторы, регуляторных элементов ДНК и РНК доступа полимеразы для ориентациигены. Ремоделирование эпигенетической пейзажа через глобальные изменения хроматина является ключевым компонентом для повторного выражения генетической программы плюрипотентности. Конкретный хроматина модификации, что играет важную роль в регуляции экспрессии генов является ацетилирование гистонов в конкретных остатков лизина, которые предоставляет доступ ко генов-мишеней за счет сокращения натяжения катушки гистона-ДНК. Ингибиторы ГДАЦ небольшие молекулы, которые были показаны, чтобы добавлять IPSC перепрограммирование и чЭСК самообновление 9,10, скорее всего, из-за поддержки ацетилированный состояние 11. Протокол, описанный ниже, взяты из предварительного публикации с использованием интегрирующих лентивирусы 12, обеспечивает шаг за шагом метод для оптимизации поколения IPSC из периферической крови с использованием эписом и ингибиторов HDAC. Концентрации ингибиторов HDAC, используемые здесь, половина из тех, описывается Ware, и др. 9, и обычно приводит к увеличению в 2 раза в полностью перепрограммировать колоний ИПСК более стандартуПротоколы перепрограммирования эписомные без ингибиторов HDAC. Этот уровень перепрограммирования находится на одном уровне с эффективностью мы наблюдаем лентивирусными методов. Используя этот протокол, мы эффективно генерируется IPSC от физических лиц в качестве старых как 87 лет.
Protocol
Representative Results
Discussion
Для успешного поколения IPSC при использовании этого протокола, есть несколько важных оговорок, которые следует учитывать. Во время стадии расширения эритробласт, график изменения массовой информации должны быть строго соблюдены, а отклонения могут привести к неэффективному стимуляци…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы признают следующие гранты от NIH для поддержки этого исследования: K08DK082783 (AR), P30DK56465 (BTS), U01HL099993 (BTS), T32HL00715036 (СКС), и K12HL0806406 (SKS); и JP Маккарти Foundation (AR).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Ficoll-Paque PLUS | Fisher Scientific | 45-001-750 | Store at 4°C. Warm to room temperature before use. |
| DPBS | Life Technologies | 14190-250 | Store at 4°C. |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11875-093 | Store at 4°C. |
| fetal bovine serum (FBS) | Life Technologies | 10437028 | Store at -20°C until needed. Thaw, aliquot, store at 4°C. |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 154938 | Store at room temperature. |
| QBSF-60 serum-free medium | Fisher Scientific | 50-983-234 | Store at 4°C. |
| penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140122 | Store at 4°C. |
| Cell Line Nucleofector Kit V | Lonza | VCA-1003 | Store at 4°C. |
| 2% gelatin solution | Sigma-Aldrich | G1393 | Store at 4°C, liquify in 37°C water bath before use. |
| Hank's Balanced Saline Solution (HBSS) | Life Technologies | 14175-103 | Store at 4°C. |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-092 | Store at 4°C. |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Life Technologies | 12440-061 | Store at 4°C. |
| L-glutamine, 200 mM | Life Technologies | 25030-081 | Aliquot, freeze at -20°C. |
| non-essential amino acids (NEAA), 100X | Life Technologies | 11140-050 | Store at 4°C, away from light. |
| DMEM/Ham's F12, 1:1 | Fisher Scientific | SH30023.02 | Store at 4°C. |
| KnockOut Serum Replacement | Life Technologies | 10828-028 | Aliquot, freeze at -20°C. |
| sodium pyruvate, 100 mM | Life Technologies | 11360-070 | Store at 4°C. |
| sodium bicarbonate, 7.5% | Life Technologies | 25080094 | Store at 4°C. |
| basic fibroblast growth factor (bFGF) | Life Technologies | PHG0263 | Make 10 mg/mL stock in DPBS, aliquot, freeze at -20°C. Once thawed, store at 4°C. |
| sodium butyrate | Sigma-Aldrich | B5887-1G | Make 2000X stock (400 mM) in DPBS, aliquot, freeze at -20°C. Once thawed, store at 4°C. |
| hES Cell Cloning & Recovery Supplement | Stemgent | 01-0014-500 | Store at -20°C until needed. Once thawed, store at 4°C. |
| ESC-qualified BD matrigel | BD Biosciences | 35-4277 | Thaw overnight on ice at 4°C, aliquot into pre-chilled tubes using pre-chilled pipette tips. Store at -20°C until needed. Thaw at 4°C, use immediately. |
| StemSpan SFEM | STEMCELL Technologies | 9650 | Aliquot, freeze at -20°C. |
| ascorbic acid, powdered | Sigma-Aldrich | A4403-100MG | Make 5 mg/mL stock in DPBS, sterile filter, store at 4°C. |
| recombinant human stem cell factor (SCF) | R & D Systems | 255-SC-010 | Make 100 μg/mL stock in SFEM, aliquot, freeze at -20°C. Once thawed, store at 4°C. |
| recombinant human interleukin 3 (IL-3) | R & D Systems | 203-IL-010 | Make 100 μg/mL stock in SFEM, aliquot, freeze at -20°C. Once thawed, store at 4°C. |
| erythropoietin (EPO) | R & D Systems | 287-TC-500 | Make 1000 U/mL stock in SFEM, aliquot, freeze at -20°C. Once thawed, store at 4°C. |
| recombinant human insulin-like growth factor 1 (IGF-1) | R & D Systems | 291-G1-200 | Make 100 μg/mL stock in SFEM, aliquot, freeze at -20°C. Once thawed, store at 4°C. |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522 | Make 1000X stock (100 mM) in DPBS. |
| dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902-25MG | Make 50X stock (50 μM) in DPBS, sterile filter, store at 4°C. |
| SAHA (vorinostat) | Cayman Chemical | 149647-78-9 | Make 2000X stock (400 mM) in DPBS, aliquot, freeze at -20°C. Once thawed, store at 4°C. |
| 12 well tissue culture plate | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| 15 mL conical tube | Sarstedt | 62553002 | |
| 1.5 mL Eppendorf tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 6 well tissue culture plate | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| 35 mm tisue culture plates | BD Biosciences | 353001 | |
| 10 mL disposable serological pipettes | Fisher Scientific | 13-675-20 | |
| 5 mL disposable serological pipettes | Fisher Scientific | 13-675-22 | |
| 2 mL disposable serological pipettes | Fisher Scientific | 13-675-17 | |
| 20 μL pipette tips, barrier tips | Genessee | 24-404 | |
| glass Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| pipette aid | Fisher Scientific | 13-681-15 | |
| pCXLE-hOCT3/4-shp53-F | Addgene | 27077 | |
| pCXLE-hSK | Addgene | 27078 | |
| pCXLE-hUL | Addgene | 27080 | |
| pCXLE-EGFP | Addgene | 27082 | |
| pCXWB-EBNA1 | Addgene | 37624 |
References
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Koche, R. P., et al. Reprogramming factor expression initiates widespread targeted chromatin remodeling. Cell Stem Cell. 8 (1), 96-105 (2011).
- Baum, C., Kustikova, O., Modlich, U., Li, Z., Fehse, B. Mutagenesis and oncogenesis by chromosomal insertion of gene transfer vectors. Human Gene Therapy. 17 (3), 253-263 (2006).
- Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448 (7151), 313-317 (2007).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324 (5928), 797-801 (2009).
- Hong, H., et al. Suppression of induced pluripotent stem cell generation by the p53-p21 pathway. Nature. 460 (7259), 1132-1135 (2009).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
- Yates, J. L., Warren, N., Sugden, B. Stable replication of plasmids derived from Epstein-Barr virus in various mammalian cells. Nature. 313 (6005), 812-815 (1985).
- Ware, C. B., et al. Histone deacetylase inhibition elicits an evolutionarily conserved self-renewal program in embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 4 (4), 359-369 (2009).
- Mali, P., et al. Butyrate greatly enhances derivation of human induced pluripotent stem cells by promoting epigenetic remodeling and the expression of pluripotency-associated genes. Stem Cells. 28 (4), 713-720 (2010).
- Azuara, V., et al. Chromatin signatures of pluripotent cell lines. Nature Cell Biology. 8 (5), 532-538 (2006).
- Sommer, A. G., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using the STEMCCA lentiviral vector. J. Vis. Exp. (68), e4327 (2012).
- Yoshida, Y., Takahashi, K., Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Hypoxia enhances the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 5, 237-241 (2009).
- Abbondanzo, S. J., Gadi, I., Stewart, C. L. Derivation of Embryonic Stem Cell Lines. Methods in Enzymology. 225, 803-823 (1993).
- Kim, H. J., Bae, S. C. Histone deacetylase inhibitors: molecular mechanisms of action and clinical trials as anti-cancer drugs. American Journal of Translational Research. 3 (2), 166-179 (2011).
