Effektiv iPS Cell Generation fra Blood hjelp episomer og HDAC hemmere

Summary

Her beskriver vi en protokoll for å generere menneskeskapte pluripotente stamceller fra perifert blod ved hjelp av en episom basert omprogrammering strategi og histondeacetylase hemmere.

Abstract

Dette manuskriptet illustrerer en protokoll for effektivt å skape integrasjon frie menneskeskapte pluripotent stamceller (iPSCs) fra perifert blod ved hjelp episomale plasmider og histondeacetylase (HDAC) hemmere. Fordelene med denne tilnærming omfatter: (1) bruk av en minimal mengde av perifert blod som en kilde materiale; (2) nonintegrating omprogrammering vektorer; (3) en kostnadseffektiv fremgangsmåte for å generere vektor frie iPSCs; (4) en enkelt transfeksjon; og (5) anvendelse av små molekyler for å lette epigenetisk omprogrammering. I korthet, blir perifere mononukleære blodceller (PBMC) isolert fra flebotomi rutineprøver og deretter dyrket i definerte vekstfaktorer for å gi et sterkt proliferativ erytrocytt progenitor-cellepopulasjonen som er bemerkelsesverdig mottagelig for omprogrammering. Nonintegrating, nontransmissible episomale plasmider uttrykker OCT4, SOX2, KLF4, MYCL, LIN28A, og en p53 kort hårnål (sh) RNA er introduced inn i de avledet erytroblaster via en enkelt nucleofection. Kotransfeksjon av en episom som uttrykker forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP) gir mulighet for enkel identifisering av transfekterte celler. En separat replikasjon-manglende plasmid som uttrykker Epstein-Barr-atom antigen 1 (EBNA1) blir også tilsatt til reaksjonsblandingen for økt ekspresjon av episomale proteiner. Transfekterte celler blir deretter sådd ut på et lag av bestrålte mus embryoniske fibroblaster (iMEFs) for fortsatt omprogrammering. Så snart IPSC-kolonier som vist på omtrent tolv dager etter nucleofection, er HDAC-inhibitorer tilsettes til mediet for å lette epigenetisk remodeling. Vi har funnet at inkludering av HDAC-inhibitorer øker rutinemessig generering av fullt omprogrammeres IPSC kolonier av 2-fold. Når IPSC kolonier utviser typisk humane embryonale stamceller (hESC) morfologi, de er forsiktig overført til individuelle iMEF-belagt vevskulturplater for fortsatt vekst og ekspansjon.

Introduction

iPSCs er utledet fra somatiske vev via ektopisk uttrykk for et minimalt sett med pluripotency gener. Denne teknikken ble først demonstrert av retrovirale transduksjon av humane fibroblaster med OCT4, SOX2, KLF4, og cMYC, som er høyt uttrykt i pluripotent tilstand ^1. Disse forbigående uttrykt "omprogrammering faktorer" endre målcellens epigenetisk landskapet og genuttrykk profil analogt til humane embryonale stamceller ^2. Når den er laget, kan iPSCs potensielt bli differensiert i noen vevstype for videre etterforskning. Dermed holder de løftet for bruk i regenerativ medisin, sykdom modellering, og genterapi applikasjoner. Imidlertid, forstyrre genomet med integrerende viruser har potensial til å endre endogent gen-ekspresjon, påvirker cellulær fenotype, og til slutt å forspenne vitenskapelige resultater. Videre kan tilfeldige integreringer virale føre til skadelige cellulære effekter, inkludert muligheten for malign transformasjon ^tre eller re-uttrykk av de onkogene transgener ^4. Fremtidige kliniske applikasjoner vil kreve ikke-integrere IPSC generasjon.

Episomer, som er ekstra kromosom sirkulære DNA-molekyler, har en strategi for å generere kostnadseffektive, integrasjon frie iPSCs ^5. Kombinasjonen av episomale vektorer som er vist i tabell 1 uttrykke omprogrammering faktorer OCT4, SOX2, KLF4, MYCL, og LIN28A. Den pCXLE_hOCT3 / 4-shp53-F-plasmidet inneholder også en p53 shRNA for midlertidig undertrykkelse av TP53 å forbedre mobilnettet omprogrammering ^6. Replikering mangel pCXWB-EBNA1 vektor fremmer forsterkning av omprogrammering faktorer og økt omprogrammering effektivitet ved å tilby en forbigående økning i EBNA1 uttrykk ^7. Den pCXLE_EGFP plasmid kan legges til nucleofection blandingen i den hensikt å Determining transfeksjonseffektiviteten eller cellesorterings anvendelser. Med unntak av p-CXWB EBNA1, de episomale plasmider anvendt i denne protokollen inneholder Epstein-Barr virus opprinnelse av viral replikasjon og EBNA1-genet, som formidler replikasjon og oppdeling av episom under delingen av vertscellen ^8. De episomer er spontant tapt med påfølgende IPSC ekspansjon ^7. Subkloning og karakterisering av iPSCs med episomal vektor tap, som kan utledes fra tap av EGFP uttrykk, kan føre til helt integrering gratis iPSCs for fremtidige kliniske applikasjoner.

Iboende til prosessen med IPSC generasjon er undertrykkelse av avstamning spesifikke gener og reaktivering av pluripotency assosierte gener. Regulering av gen-ekspresjon forekommer på flere nivåer i kjernen, herunder modifiseringer av DNA og kromatin å tillate transkripsjonsfaktorer, regulatoriske DNA-elementer, og RNA-polymerase tilgang til måletgener. Ombygging av epigenetisk landskapet via globale kromatin modifikasjoner er en viktig komponent for å re-uttrykk for pluripotency genetisk program. En spesifikk modifikasjon kromatin som er viktig i reguleringen av genekspresjon er acetylering av histoner på bestemte lysinrester, som tillater tilgang til målgener ved redusert spenning av histon-DNA-spiral. HDAC hemmere er små molekyler som har vist seg å forbedre IPSC omprogrammering og hESC selvfornyelse ^9,10, trolig på grunn av støtte acetylerte staten ^11. Protokollen er beskrevet nedenfor, tilpasset fra en tidligere publikasjon hjelp integrere lentiviruses ^12, gir en trinn-for-trinn metode for optimalisert IPSC generasjon fra perifert blod ved hjelp episomer og HDAC hemmere. De HDAC-inhibitor-konsentrasjoner som brukes her, er halvparten av de som er beskrevet av Ware, et al. ^9, og har rutinemessig ført til en to gangers økning i fullt omprogrammerte IPSC kolonier enn standardepisomale omprogrammering protokoller uten HDAC hemmere. Dette nivået av omprogrammering er på linje med effektiviteten vi observerer med lentiviral metoder. Ved hjelp av denne protokollen, har vi effektivt generert IPSC fra enkeltpersoner så gammel som 87 år.

Protocol

Skriftlig informert samtykke, som er godkjent av Institutional Review Styrene i Fred Hutchinson Cancer Research Center og Children "s Hospital of Philadelphia, ble innhentet fra pasienter før samle perifere blodprøver. Alle institusjonelle retningslinjer ble observert. Alle dyreforsøk inkludert MEF generasjon og teratom dannelse ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité. 1. Ficoll Separasjon av PBMC og Utvidelse av erytroblaster – dag 0 Fortynne perifert bl…

Representative Results

Tre dager etter nucleofection og før utplating av cellene på nucleofected iMEFs, bør effektiviteten av vellykket nucleofection estimeres ved fluorescens mikroskopi for EGFP. Figur 1 viser et typisk eksperiment nucleofection med ca. 5-10% av den totale cellepopulasjon som uttrykker EGFP. Omprogrammerte IPSC kolonier vil begynne å dukke opp ca to uker etter nucleofection. Koloniene er generelt rundskriv med veldefinerte grenser og kan identifiseres ved karakteristiske hESC…

Discussion

For vellykket IPSC generasjon når du bruker denne protokollen, er det flere viktige begrensninger som bør vurderes. Under erytroblast utvidelse scenen, bør media endring planen følges nøye, som avvik kan føre til ineffektiv stimulering av målet stamcelle befolkning og en lavere virkningsgrad på IPSC generasjon. Det er viktig å lage nye utvidelsen medium med frisk deksametason med hver medie endring; og QBSF-60 basismedium og deksametason bør beskyttes mot lys under lagring. Under nucleofection, er DPBS vaske k…

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Ficoll-Paque PLUS	Fisher Scientific	45-001-750	Store at 4°C. Warm to room temperature before use.
DPBS	Life Technologies	14190-250	Store at 4°C.
RPMI 1640	Life Technologies	11875-093	Store at 4°C.
fetal bovine serum (FBS)	Life Technologies	10437028	Store at -20°C until needed. Thaw, aliquot, store at 4°C.
dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	154938	Store at room temperature.
QBSF-60 serum-free medium	Fisher Scientific	50-983-234	Store at 4°C.
penicillin/streptomycin	Life Technologies	15140122	Store at 4°C.
Cell Line Nucleofector Kit V	Lonza	VCA-1003	Store at 4°C.
2% gelatin solution	Sigma-Aldrich	G1393	Store at 4°C, liquify in 37°C water bath before use.
Hank's Balanced Saline Solution (HBSS)	Life Technologies	14175-103	Store at 4°C.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Life Technologies	11965-092	Store at 4°C.
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)	Life Technologies	12440-061	Store at 4°C.
L-glutamine, 200 mM	Life Technologies	25030-081	Aliquot, freeze at -20°C.
non-essential amino acids (NEAA), 100X	Life Technologies	11140-050	Store at 4°C, away from light.
DMEM/Ham's F12, 1:1	Fisher Scientific	SH30023.02	Store at 4°C.
KnockOut Serum Replacement	Life Technologies	10828-028	Aliquot, freeze at -20°C.
sodium pyruvate, 100 mM	Life Technologies	11360-070	Store at 4°C.
sodium bicarbonate, 7.5%	Life Technologies	25080094	Store at 4°C.
basic fibroblast growth factor (bFGF)	Life Technologies	PHG0263	Make 10 mg/mL stock in DPBS, aliquot, freeze at -20°C. Once thawed, store at 4°C.
sodium butyrate	Sigma-Aldrich	B5887-1G	Make 2000X stock (400 mM) in DPBS, aliquot, freeze at -20°C. Once thawed, store at 4°C.
hES Cell Cloning & Recovery Supplement	Stemgent	01-0014-500	Store at -20°C until needed. Once thawed, store at 4°C.
ESC-qualified BD matrigel	BD Biosciences	35-4277	Thaw overnight on ice at 4°C, aliquot into pre-chilled tubes using pre-chilled pipette tips. Store at -20°C until needed. Thaw at 4°C, use immediately.
StemSpan SFEM	STEMCELL Technologies	9650	Aliquot, freeze at -20°C.
ascorbic acid, powdered	Sigma-Aldrich	A4403-100MG	Make 5 mg/mL stock in DPBS, sterile filter, store at 4°C.
recombinant human stem cell factor (SCF)	R & D Systems	255-SC-010	Make 100 μg/mL stock in SFEM, aliquot, freeze at -20°C. Once thawed, store at 4°C.
recombinant human interleukin 3 (IL-3)	R & D Systems	203-IL-010	Make 100 μg/mL stock in SFEM, aliquot, freeze at -20°C. Once thawed, store at 4°C.
erythropoietin (EPO)	R & D Systems	287-TC-500	Make 1000 U/mL stock in SFEM, aliquot, freeze at -20°C. Once thawed, store at 4°C.
recombinant human insulin-like growth factor 1 (IGF-1)	R & D Systems	291-G1-200	Make 100 μg/mL stock in SFEM, aliquot, freeze at -20°C. Once thawed, store at 4°C.
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M7522	Make 1000X stock (100 mM) in DPBS.
dexamethasone	Sigma-Aldrich	D4902-25MG	Make 50X stock (50 μM) in DPBS, sterile filter, store at 4°C.
SAHA (vorinostat)	Cayman Chemical	149647-78-9	Make 2000X stock (400 mM) in DPBS, aliquot, freeze at -20°C. Once thawed, store at 4°C.
12 well tissue culture plate	Fisher Scientific	08-772-29
15 mL conical tube	Sarstedt	62553002
1.5 mL Eppendorf tube	Fisher Scientific	05-408-129
6 well tissue culture plate	Fisher Scientific	08-772-1B
35 mm tisue culture plates	BD Biosciences	353001
10 mL disposable serological pipettes	Fisher Scientific	13-675-20
5 mL disposable serological pipettes	Fisher Scientific	13-675-22
2 mL disposable serological pipettes	Fisher Scientific	13-675-17
20 μL pipette tips, barrier tips	Genessee	24-404
glass Pasteur pipettes	Fisher Scientific	13-678-20D
pipette aid	Fisher Scientific	13-681-15
pCXLE-hOCT3/4-shp53-F	Addgene	27077
pCXLE-hSK	Addgene	27078
pCXLE-hUL	Addgene	27080
pCXLE-EGFP	Addgene	27082
pCXWB-EBNA1	Addgene	37624