Effektiv iPS cell Generation från Blood Använda episomer och HDAC inhibitorer

Summary

Här beskriver vi ett protokoll för att generera mänskliga inducerade pluripotenta stamceller från perifert blod med hjälp av en episom baserad omprogrammering strategi och histondeacetylas hämmare.

Abstract

Detta manuskript illustrerar ett protokoll för effektivt skapa integrationsfria mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) från perifert blod med hjälp av episomala plasmider och histondeacetylas (HDAC) -hämmare. Fördelarna med denna metod innefattar: (1) användning av en minimal mängd av perifert blod som utgångsmaterial; (2) nonintegrating omprogrammering vektorer; (3) en kostnadseffektiv metod för att generera vektorfria iPSCs; (4) en enda transfektion; och (5) användning av små molekyler för att underlätta epigenetisk omprogrammering. Kortfattat, perifera mononukleära blodceller (PBMC) isolerades från rutin flebotomi prover och odlades sedan i definierade tillväxtfaktorer för att ge ett starkt proliferativt erytrocyt populationen av progenitorceller som är anmärkningsvärt mottaglig för omprogrammering. Nonintegrating, nontransmissible episomala plasmider uttrycker Oct4, Sox2, Klf4, MYCL, LIN28A och en p53 kort hårnål (sh) RNA är introduced in de härledda erytroblaster via en enda nucleofection. Samtransfektion av en episom som uttrycker förbättrade grönt fluorescerande protein (EGFP) möjliggör enkel identifiering av transfekterade celler. En separat replikerande plasmid som uttrycker Epstein-Barr-kärnantigen 1 (EBNA1) sätts också till reaktionsblandningen för ökad expression av episomala proteiner. Transfekterade celler stryks sedan ut på ett skikt av bestrålat mus embryonala fibroblaster (iMEFs) för fortsatt omprogrammering. Så snart iPSC lika kolonier uppträder vid ungefär tolv dagar efter nucleofection, är HDAC-hämmare sättas till mediet för att underlätta epigenetisk ombyggnad. Vi har funnit att införlivandet av HDAC-hämmare rutinmässigt ökar alstringen av fullt omprogrammerade IPSC kolonier av 2-faldigt. När IPSC kolonier uppvisar typiska mänskliga embryonala stamceller (hESC) morfologi, de är försiktigt över till enskilda Imef-belagda vävnadsodlingsplattor för fortsatt tillväxt och expansion.

Introduction

iPSCs härrör från somatiska vävnader via ektopisk uttryck för en minimal uppsättning pluripotensbestämmande gener. Denna teknik var ursprungligen visas genom retroviral transduktion av humana fibroblaster med Oct4, Sox2, Klf4 och cMYC, som är mycket uttrycks i pluripotent tillstånd ^1. Dessa övergående uttryckt "omprogrammering faktorer" förändrar målcellens epigenetisk landskapet och genuttryck profil analog med mänskliga embryonala stamceller ^2. När du väl skapat, kan iPSCs potentiellt differentieras i någon vävnadstyp för vidare utredning. Således håller de lovande för användning inom regenerativ medicin, sjukdomsmodellering och genterapitillämpningar. Men stör genomet med integrerande virus har potential att förändra endogen genexpression, inflytande cellulär fenotyp, och i slutändan förspänna vetenskapliga resultat. Dessutom kan slump virala integrationer leda till skadlig cellulär effekter, bland annat möjligheten för malign transformation ³ eller åter uttryck av de onkogena transgener ^4. Framtida kliniska applikationer kommer att kräva icke-integrerande iPSC generation.

Episomer, som är extra kromosom cirkulära DNA-molekyler, har en strategi för att skapa kostnadseffektiva, integration fria iPSCs ^5. Kombinationen av episomala vektorer som visas i tabell 1 uttrycka omprogrammeringen faktorer Oct4, Sox2, Klf4, MYCL och LIN28A. Den pCXLE_hOCT3 / 4-shp53-F-plasmiden innehåller även ett p53 shRNA för tillfällig suppression av TP53 för att förbättra cellulär omprogrammering ^6. Den replikerande pCXWB-EBNA1 vektor främjar amplifieringen av omprogrammeringsinstruktioner faktorer och ökad omprogrammering effektivitet genom att tillhandahålla en övergående ökning av EBNA1 expression ^7. Den pCXLE_EGFP plasmiden kan tillsättas till den nucleofection blandningen i syfte att determining transfektionseffektiviteten eller för cellsorteringstillämpningar. Med undantag för p CXWB-EBNA1 de episomala plasmider som används i detta protokoll innehåller Epstein-Barr-virus ursprung av viral replikation och EBNA1-genen, som medierar replikation och delning av episom under delning av värdcellen ^8. De episomer spontant förlorade med successiv iPSC expansionen ^7. Subkloning och karakterisering av iPSCs med episomal vektor förlust, vilket kan utläsas av förlust av EGFP uttryck, kan leda till helt integrations fria iPSCs för framtida kliniska tillämpningar.

Inneboende till processen för iPSC generation är undertryckande av härstamning specifika gener och reaktivering av pluripotens-associerade gener. Reglering av genuttryck sker på flera nivåer i kärnan, inbegripet ändringar DNA och kromatin att tillåta transkriptionsfaktorer, regulatoriska DNA-element, och RNA-polymeras tillgång till målgener. Ombyggnad av den epigenetiska landskapet via globala kromatin ändringar är en viktig komponent för att åter uttryck för pluripotens genetiska programmet. En specifik kromatin modifiering som är viktig i regleringen av genuttryck är acetylering av histoner vid särskilda lysinrester, vilket ger tillgång till målet gener genom minskad spänning histon-DNA pole. HDAC-hämmare är små molekyler som har visat sig öka iPSC omprogrammering och hESC självförnyelse ^9,10, sannolikt på grund av att stödja den acetylerade staten ^11. Protokollet som beskrivs nedan, anpassad från en tidigare publikation med hjälp av integrerande lentiviruses ^12, ger en steg-för-steg metod för optimerad iPSC generering från perifert blod med hjälp episomer och HDAC-hämmare. Koncentrationerna HDAC-inhibitor som används här är hälften av de som beskrivs av Ware et al., ^9, och har rutinmässigt lett till en 2-faldig ökning i fullt omprogrammerade IPSC kolonier över standardenepisomala omprogrammering protokoll utan HDAC-hämmare. Denna nivå av omprogrammering är i nivå med effektiviteten som vi observerar med lentivirala metoder. Med hjälp av detta protokoll, har vi på ett effektivt sätt genererat iPSC från individer som gamla som 87 år.

Protocol

Skriftligt informerat samtycke, som godkänts av Institutional Review Boards för Fred Hutchinson Cancer Research Center och Children "s Hospital of Philadelphia, erhölls från patienter innan samla perifera blodprover. Alla institutionella riktlinjer observerades. Alla djurförsök inklusive MEF generation och teratom bildningen godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittén. 1. Ficoll Separation av PBMC och Expansion av erytroblaster – Dag 0 Späd perif…

Representative Results

Tre dagar efter nucleofection och före utstrykning av nucleofected celler på iMEFs bör effektiviteten av framgångsrik nucleofection uppskattas genom fluorescensmikroskopi för EGFP. Figur 1 visar en typisk nucleofection experiment med ungefär 5-10% av den totala cellpopulationen som uttrycker EGFP. Omprogrammerade IPSC kolonier kommer att börja visas ungefär två veckor efter nucleofection. Kolonierna är generellt cirkulär med väldefinierade gränser och kan identi…

Discussion

För framgångsrik iPSC generation när du använder detta protokoll, finns det flera viktiga förbehåll som bör beaktas. Under erytroblast expansionsfasen, bör medieförändringen schemat följas strikt, eftersom avvikelser kan leda till ineffektiva stimulering av målet stamceller befolkning och en lägre verkningsgrad iPSC generation. Det är viktigt att göra nya expansionen medium med färska dexametason med varje medieförändring; och QBSF-60 basmedium och dexametason bör skyddas från ljus under lagring. Und…

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Ficoll-Paque PLUS	Fisher Scientific	45-001-750	Store at 4°C. Warm to room temperature before use.
DPBS	Life Technologies	14190-250	Store at 4°C.
RPMI 1640	Life Technologies	11875-093	Store at 4°C.
fetal bovine serum (FBS)	Life Technologies	10437028	Store at -20°C until needed. Thaw, aliquot, store at 4°C.
dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	154938	Store at room temperature.
QBSF-60 serum-free medium	Fisher Scientific	50-983-234	Store at 4°C.
penicillin/streptomycin	Life Technologies	15140122	Store at 4°C.
Cell Line Nucleofector Kit V	Lonza	VCA-1003	Store at 4°C.
2% gelatin solution	Sigma-Aldrich	G1393	Store at 4°C, liquify in 37°C water bath before use.
Hank's Balanced Saline Solution (HBSS)	Life Technologies	14175-103	Store at 4°C.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Life Technologies	11965-092	Store at 4°C.
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)	Life Technologies	12440-061	Store at 4°C.
L-glutamine, 200 mM	Life Technologies	25030-081	Aliquot, freeze at -20°C.
non-essential amino acids (NEAA), 100X	Life Technologies	11140-050	Store at 4°C, away from light.
DMEM/Ham's F12, 1:1	Fisher Scientific	SH30023.02	Store at 4°C.
KnockOut Serum Replacement	Life Technologies	10828-028	Aliquot, freeze at -20°C.
sodium pyruvate, 100 mM	Life Technologies	11360-070	Store at 4°C.
sodium bicarbonate, 7.5%	Life Technologies	25080094	Store at 4°C.
basic fibroblast growth factor (bFGF)	Life Technologies	PHG0263	Make 10 mg/mL stock in DPBS, aliquot, freeze at -20°C. Once thawed, store at 4°C.
sodium butyrate	Sigma-Aldrich	B5887-1G	Make 2000X stock (400 mM) in DPBS, aliquot, freeze at -20°C. Once thawed, store at 4°C.
hES Cell Cloning & Recovery Supplement	Stemgent	01-0014-500	Store at -20°C until needed. Once thawed, store at 4°C.
ESC-qualified BD matrigel	BD Biosciences	35-4277	Thaw overnight on ice at 4°C, aliquot into pre-chilled tubes using pre-chilled pipette tips. Store at -20°C until needed. Thaw at 4°C, use immediately.
StemSpan SFEM	STEMCELL Technologies	9650	Aliquot, freeze at -20°C.
ascorbic acid, powdered	Sigma-Aldrich	A4403-100MG	Make 5 mg/mL stock in DPBS, sterile filter, store at 4°C.
recombinant human stem cell factor (SCF)	R & D Systems	255-SC-010	Make 100 μg/mL stock in SFEM, aliquot, freeze at -20°C. Once thawed, store at 4°C.
recombinant human interleukin 3 (IL-3)	R & D Systems	203-IL-010	Make 100 μg/mL stock in SFEM, aliquot, freeze at -20°C. Once thawed, store at 4°C.
erythropoietin (EPO)	R & D Systems	287-TC-500	Make 1000 U/mL stock in SFEM, aliquot, freeze at -20°C. Once thawed, store at 4°C.
recombinant human insulin-like growth factor 1 (IGF-1)	R & D Systems	291-G1-200	Make 100 μg/mL stock in SFEM, aliquot, freeze at -20°C. Once thawed, store at 4°C.
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M7522	Make 1000X stock (100 mM) in DPBS.
dexamethasone	Sigma-Aldrich	D4902-25MG	Make 50X stock (50 μM) in DPBS, sterile filter, store at 4°C.
SAHA (vorinostat)	Cayman Chemical	149647-78-9	Make 2000X stock (400 mM) in DPBS, aliquot, freeze at -20°C. Once thawed, store at 4°C.
12 well tissue culture plate	Fisher Scientific	08-772-29
15 mL conical tube	Sarstedt	62553002
1.5 mL Eppendorf tube	Fisher Scientific	05-408-129
6 well tissue culture plate	Fisher Scientific	08-772-1B
35 mm tisue culture plates	BD Biosciences	353001
10 mL disposable serological pipettes	Fisher Scientific	13-675-20
5 mL disposable serological pipettes	Fisher Scientific	13-675-22
2 mL disposable serological pipettes	Fisher Scientific	13-675-17
20 μL pipette tips, barrier tips	Genessee	24-404
glass Pasteur pipettes	Fisher Scientific	13-678-20D
pipette aid	Fisher Scientific	13-681-15
pCXLE-hOCT3/4-shp53-F	Addgene	27077
pCXLE-hSK	Addgene	27078
pCXLE-hUL	Addgene	27080
pCXLE-EGFP	Addgene	27082
pCXWB-EBNA1	Addgene	37624