Yeast proteinopathy models are valuable tools to assess the toxicity and aggregation of proteins implicated in disease. Here, we present methods for screening Hsp104 variant libraries for toxicity suppressors. This protocol could be adapted to screen any protein library for toxicity suppressors of any protein that is toxic in yeast.
Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic lateral sclerosis, and α-synuclein, implicated in Parkinson’s disease, are toxic and form cytoplasmic aggregates in yeast. These features recapitulate protein pathologies observed in patients with these disorders. Thus, yeast are an ideal platform for isolating toxicity suppressors from libraries of protein variants. We are interested in applying protein disaggregases to eliminate misfolded toxic protein conformers. Specifically, we are engineering Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast that is uniquely capable of solubilizing both disordered aggregates and amyloid and returning the proteins to their native conformations. While Hsp104 is highly conserved in eukaryotes and eubacteria, it has no known metazoan homologue. Hsp104 has only limited ability to eliminate disordered aggregates and amyloid fibers implicated in human disease. Thus, we aim to engineer Hsp104 variants to reverse the protein misfolding implicated in neurodegenerative disorders. We have developed methods to screen large libraries of Hsp104 variants for suppression of proteotoxicity in yeast. As yeast are prone to spontaneous nonspecific suppression of toxicity, a two-step screening process has been developed to eliminate false positives. Using these methods, we have identified a series of potentiated Hsp104 variants that potently suppress the toxicity and aggregation of TDP-43, FUS, and α-synuclein. Here, we describe this optimized protocol, which could be adapted to screen libraries constructed using any protein backbone for suppression of toxicity of any protein that is toxic in yeast.
Levedura proteinopathy modelos têm sido desenvolvidos para distúrbios-misfolding proteína incluindo a esclerose lateral amiotrófica (ELA) e a doença de Parkinson (DP) 1-3. Expressão das proteínas TDP-43 e FUS, que misfold em pacientes de ELA, são tóxicos e mislocalize para formar agregados citoplasmáticos em levedura 1,2. Do mesmo modo, a expressão de α-sinucleína (α-syn), que está implicado na doença de Parkinson, é tóxico e mislocalizes para formar agregados citoplasmáticos em 3 de levedura. Esses recursos recapitular fenótipos em pacientes com esses transtornos 4,5. Assim, os modelos de levedura fornecer uma plataforma útil para o rastreio de proteínas ou moléculas pequenas que impedem ou invertem estes fenótipos 2,6-13. Estamos interessados no desenvolvimento de proteínas que são capazes de inverter a agregação e toxicidade devido a TDP-43, FUS, e α-syn. Nós nos concentramos em Hsp104, um AAA + proteína de levedura que é o único capaz de desagregar proteínas tanto fragregados amorfos om e amilóide em leveduras, ainda não tem homólogo humano 14,15. Hsp104 é afinado para desagregar prions levedura endógenos e tem apenas capacidade limitada para desagregar substratos implicados em doenças neurodegenerativas humanas, que nunca encontra ordinariamente 16,17. Assim, nosso objetivo é projetar versões aprimoradas de Hsp104 que são capazes de desagregar eficazmente estes substratos humanos. Para isso, construímos grandes bibliotecas de Hsp104 variantes utilizando PCR propenso a erros; essas bibliotecas podem ser rastreados usando os modelos de levedura proteinopathy 17. Adotamos uma abordagem orientada-domínio para construção e pesquisa de bibliotecas, como Hsp104 é muito grande 17. Nós centrou-se inicialmente no domínio médio (DM) de Hsp104 17, embora as abordagens semelhantes podem ser empregues para o rastreio de outros domínios. Esses modelos permitem o rastreio de actividade disaggregase directamente, ao contrário de técnicas alternativas, tais como exposição de superfície, que é restoricted usar para monitorar a ligação 18.
O protocolo baseia-se em dois passos de triagem (Figura 1). Em primeiro lugar, as variantes de Hsp104 que suprimem a toxicidade do substrato doença em levedura são seleccionados. Para fazê-lo, a Hsp104 variantes e associado à doença substrato são co-transformados em levedura Δ Hsp104. Nós empregamos Δ Hsp104 levedura para explorar Hsp104 seqüência espaço na ausência de tipo selvagem (WT) Hsp104 17. Importante, supressão de Hsp104 não afecta α-syn, FUS, ou TDP-43 toxicidade em levedura, e expressão de Hsp104 WT fornece salvamento mínima 1,13,17. A levedura é então plaqueadas em meios de indução para induzir a expressão de ambas as proteínas. Levedura abrigar variantes Hsp104 que suprimem a toxicidade do associado à doença de crescimento substrato conferem da colônia. Estas variantes são seleccionados para posterior análise, mantendo ao mesmo tempo as colónias variantes que não suprimem a toxicidade da matriz. No entanto,falsos positivos são um problema substancial na tela. Expressão de TDP-43, FUS, e α-syn são altamente tóxicos, o que cria uma forte pressão selectiva para o aparecimento de supressores genéticas espontâneas de toxicidade relacionada com a variante Hsp104 ser expresso. Assim, temos utilizado uma tela secundária que também é relativamente alto rendimento para eliminar esses supressores de toxicidade inespecíficos 17. Nesta tela secundária, leveduras selecionadas são tratados com 5-Fluorootic ácido (5-FOA) para combater a seleção para o plasmídeo Hsp104 19. As estirpes são então avaliadas para substrato (TDP-43, FUS, ou α-sin) toxicidade via ensaio de mancha para assegurar que a toxicidade do substrato é restaurada após a perda do plasmídeo Hsp104. Assim, de levedura, em que a toxicidade é restaurada neste ecrã secundário originalmente apresentado presumivelmente supressão de toxicidade devido à presença da variante da Hsp104. Estas leveduras são designados como 'hits' e do plasmídeo Hsp104 deve, então, serrecuperados e sequenciados para identificar as mutações no gene de Hsp104 17 (Figura 1). Qualquer resultado deve ser reconfirmada em seguida, através da construção da mutação, independentemente, utilizando mutagénese dirigida ao local e, em seguida, para a supressão de novo teste de toxicidade. As potenciais aplicações para este protocolo são amplas. Usando estes métodos, bibliotecas de qualquer tipo de proteína pode ser rastreada para as variantes que suprimem a toxicidade da proteína de qualquer substrato que é tóxico em levedura.
Aqui apresentamos nossa abordagem para isolar variantes Hsp104 potencializadas que suprimem a toxicidade de substratos associados à doença, utilizando modelos de levedura proteinopathy. Utilizando esta abordagem, bibliotecas grandes de variantes pode ser rastreada em elevado rendimento, com a única limitação é o número de variantes que passam o ecrã secundário 5-FOA. Ao realizar estes passos em formato de 96 poços, que rotineiramente tela até 200 batidas de cada vez no passo 5-FOA ao longo de 1-2 semanas. O n…
The authors have nothing to disclose.
We thank Sue Lindquist, Aaron Gitler, and Martin Duennwald for kindly sharing reagents. Our studies were supported by: an American Heart Association Post-Doctoral Fellowship (M.E.J); NIH Director’s New Innovator Award DP2OD002177, NIH grants R21NS067354, R21HD074510, and R01GM099836, a Muscular Dystrophy Association Research Award (MDA277268), Packard Center for ALS Research at Johns Hopkins University, Target ALS, and an Ellison Medical Foundation New Scholar in Aging Award (J.S.).
Table of Specific Materials/Equipment | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
GeneMorphII EZClone Domain Mutagenesis Kit | Agilent | 200552 | |
150mm Petri dishes | Falcon | 351058 | |
5-Fluorootic Acid | Research Products International | f10501-5.0 | |
96-DeepWell 2mL Plates | Eppendorf | 0030 502.302 | |
96 bold replicator tool | V&P Scientific | vp-404 | |
ExoSAP-IT | Affymetrix | 78200 |