Aislar Potenciada Hsp104 Variantes Usando levadura Modelos proteinopatía

Summary

Yeast proteinopathy models are valuable tools to assess the toxicity and aggregation of proteins implicated in disease. Here, we present methods for screening Hsp104 variant libraries for toxicity suppressors. This protocol could be adapted to screen any protein library for toxicity suppressors of any protein that is toxic in yeast.

Abstract

Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic lateral sclerosis, and α-synuclein, implicated in Parkinson’s disease, are toxic and form cytoplasmic aggregates in yeast. These features recapitulate protein pathologies observed in patients with these disorders. Thus, yeast are an ideal platform for isolating toxicity suppressors from libraries of protein variants. We are interested in applying protein disaggregases to eliminate misfolded toxic protein conformers. Specifically, we are engineering Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast that is uniquely capable of solubilizing both disordered aggregates and amyloid and returning the proteins to their native conformations. While Hsp104 is highly conserved in eukaryotes and eubacteria, it has no known metazoan homologue. Hsp104 has only limited ability to eliminate disordered aggregates and amyloid fibers implicated in human disease. Thus, we aim to engineer Hsp104 variants to reverse the protein misfolding implicated in neurodegenerative disorders. We have developed methods to screen large libraries of Hsp104 variants for suppression of proteotoxicity in yeast. As yeast are prone to spontaneous nonspecific suppression of toxicity, a two-step screening process has been developed to eliminate false positives. Using these methods, we have identified a series of potentiated Hsp104 variants that potently suppress the toxicity and aggregation of TDP-43, FUS, and α-synuclein. Here, we describe this optimized protocol, which could be adapted to screen libraries constructed using any protein backbone for suppression of toxicity of any protein that is toxic in yeast.

Introduction

Modelos proteinopatía de levadura se han desarrollado para los trastornos de proteínas misfolding incluyendo esclerosis lateral amiotrófica (ALS) y la enfermedad de Parkinson (PD) ^1-3. Expresión de las proteínas TDP-43 y FUS, que se pliegan inadecuadamente en pacientes con ELA, son tóxicos y mislocalize para formar agregados citoplasmáticos en la levadura ^1,2. Del mismo modo, la expresión de α-sinucleína (α-syn), que está implicado en la EP, es tóxico y mislocalizes para formar agregados citoplasmáticos en la levadura ^3. Estas características recapitulan fenotipos en los pacientes con estos trastornos ^4,5. Por lo tanto, los modelos de levadura proporcionan una plataforma útil para la detección de proteínas o moléculas pequeñas que prevenir o revertir estos fenotipos ^2,6-13. Estamos interesados ​​en el desarrollo de las proteínas que son capaces de revertir la agregación y la toxicidad debido a la TDP-43, FUS, y α-syn. Nos centramos en Hsp104, un AAA + proteína de la levadura que es el único capaz de desagregar las proteínas tanto fragregados amorfos om y amiloide en la levadura, sin embargo, no tiene homólogo humano ^14,15. Hsp104 está bien afinado para desagregar los priones de levadura endógenos y sólo tiene una capacidad limitada para desagregar sustratos implicados en enfermedades neurodegenerativas humanas, que nunca encuentra con ordinariamente ^16,17. Por lo tanto, nuestro objetivo es diseñar versiones mejoradas de Hsp104 que son capaces de desagregar eficazmente estos sustratos humanos. Para ello, construimos grandes bibliotecas de variantes Hsp104 usando PCR propensa a errores; estas bibliotecas se pueden cribar utilizando los modelos proteinopatía levadura ^17. Hemos adoptado un enfoque de dominio orientados a la construcción y selección de bibliotecas, como Hsp104 es muy grande ^17. Al principio nos centramos en el dominio del medio (MD) de Hsp104 ^17, aunque los enfoques similares pueden ser empleados para detectar otros dominios. Estos modelos permiten la detección de la actividad disaggregase directamente, en contraposición a las técnicas alternativas tales como la presentación en superficie, que es el descansoricted utilizar para el seguimiento de la unión ^18.

Nuestro protocolo se basa en dos pasos de detección (Figura 1). En primer lugar, se seleccionan variantes Hsp104 que suprimen la toxicidad del sustrato enfermedad en la levadura. Para ello, la Hsp104 variantes y la enfermedad asociada sustrato se cotransformación de la levadura Hsp104 Δ. Empleamos Δ Hsp104 levadura para explorar Hsp104 secuencia espacio en ausencia de tipo salvaje (WT) Hsp104 ^17. Es importante destacar que, la supresión de Hsp104 no afecta α-syn, FUS, o TDP-43 toxicidad en la levadura, y la expresión de Hsp104 ^WT proporciona mínima de rescate ^1,13,17. La levadura está chapada a continuación, en la inducción de los medios de comunicación para inducir la expresión de ambas proteínas. La levadura que alberga variantes Hsp104 que suprimen la toxicidad del crecimiento confieren sustrato asociado a la enfermedad de la colonia. Estas variantes se seleccionan para su posterior análisis, mientras que el mantenimiento de colonias variantes que no suprimen troquel toxicidad. Sin embargo,falsos positivos son un problema importante en esta pantalla. Expresión de TDP-43, FUS, y α-syn son altamente tóxicos, que crea una fuerte presión selectiva para la aparición de supresores genéticos espontáneos de la toxicidad no relacionada con la variante de Hsp104 ser expresado. Por lo tanto, hemos utilizado una pantalla secundaria que es también relativamente de alto rendimiento para eliminar estos supresores de toxicidad no específica ^17. En esta pantalla secundaria, levadura seleccionada se tratan con Fluorootic 5-ácido (5-FOA) para contrarrestar seleccione para el plásmido Hsp104 ^19. Las cepas se evaluaron entonces por el sustrato (TDP-43, FUS, o α-syn) toxicidad a través de la detección de ensayo para asegurarse de que la toxicidad del sustrato se restaura después de la pérdida del plásmido Hsp104. Por lo tanto, la levadura en la que la toxicidad se restaura en esta pantalla secundaria presumiblemente originalmente muestra la supresión de toxicidad debido a la presencia de la variante de Hsp104. Estas levaduras se designan como "hits" y el plásmido Hsp104 debe entonces serrecuperado y secuenciado para identificar las mutaciones en el gen Hsp104 ¹⁷ (Figura 1). Cualquier resultado debe entonces ser reconfirmados mediante la construcción de la mutación de forma independiente mediante mutagénesis dirigida al sitio y luego volver a probar para la supresión de la toxicidad. Las aplicaciones potenciales de este protocolo son amplias. Usando estos métodos, las bibliotecas de cualquier tipo de proteína podrían ser examinados para variantes que suprimen la toxicidad de cualquier proteína sustrato que es tóxico en la levadura.

Protocol

1. Biblioteca Generación Para construir bibliotecas de Hsp104 utilizando PCR propensa a error de dominio específico, primero amplificar el dominio de interés con un error de ADN polimerasa propensa 20. Se purificó el producto de PCR mediante extracción en gel. Realizar un paso de extensión megacebador utilizando un protocolo estándar de mutagénesis dirigida al sitio: combinar plásmido molde 50 ng, 250 ng megacebador, 200 mM dNTPs, y de alta fidelidad de ADN polimerasa e…

Representative Results

Hemos construido una biblioteca de variantes Hsp104 aleatorios en el dominio medio y se tamiza para la supresión de la TDP-43 toxicidad. La biblioteca se transformó y colocó en placas sobre placas de glucosa y galactosa (Figura 2) para evaluar la severidad de la pantalla. Se seleccionaron colonias individuales y las cepas se seleccionaron usando contador de 5-FOA para eliminar el plásmido Hsp104. Estas cepas se evaluaron entonces para confirmar que la toxicidad era debido a la TDP-43 solo, sin las v…

Discussion

Aquí presentamos nuestro enfoque para aislar variantes Hsp104 potenciadas que suprimen la toxicidad de los sustratos de las enfermedades asociadas que utilizan modelos proteinopatía levadura. Usando este enfoque, las grandes bibliotecas de variantes se pueden cribar en alto rendimiento, con la única limitación es el número de variantes que pasan la pantalla secundaria 5-FOA. Mediante la realización de estos pasos en formato de 96 pocillos, se examinan habitualmente hasta 200 hits en un momento en el paso 5-FOA en …

Materials

Table of Specific Materials/Equipment
Name	Company	Catalog Number	Comments
GeneMorphII EZClone Domain Mutagenesis Kit	Agilent	200552
150mm Petri dishes	Falcon	351058
5-Fluorootic Acid	Research Products International	f10501-5.0
96-DeepWell 2mL Plates	Eppendorf	0030 502.302
96 bold replicator tool	V&P Scientific	vp-404
ExoSAP-IT	Affymetrix	78200