בידוד דוגמניות Proteinopathy שמרי שימוש potentiated Hsp104 גרסאות
Summary
Yeast proteinopathy models are valuable tools to assess the toxicity and aggregation of proteins implicated in disease. Here, we present methods for screening Hsp104 variant libraries for toxicity suppressors. This protocol could be adapted to screen any protein library for toxicity suppressors of any protein that is toxic in yeast.
Abstract
Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic lateral sclerosis, and α-synuclein, implicated in Parkinson’s disease, are toxic and form cytoplasmic aggregates in yeast. These features recapitulate protein pathologies observed in patients with these disorders. Thus, yeast are an ideal platform for isolating toxicity suppressors from libraries of protein variants. We are interested in applying protein disaggregases to eliminate misfolded toxic protein conformers. Specifically, we are engineering Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast that is uniquely capable of solubilizing both disordered aggregates and amyloid and returning the proteins to their native conformations. While Hsp104 is highly conserved in eukaryotes and eubacteria, it has no known metazoan homologue. Hsp104 has only limited ability to eliminate disordered aggregates and amyloid fibers implicated in human disease. Thus, we aim to engineer Hsp104 variants to reverse the protein misfolding implicated in neurodegenerative disorders. We have developed methods to screen large libraries of Hsp104 variants for suppression of proteotoxicity in yeast. As yeast are prone to spontaneous nonspecific suppression of toxicity, a two-step screening process has been developed to eliminate false positives. Using these methods, we have identified a series of potentiated Hsp104 variants that potently suppress the toxicity and aggregation of TDP-43, FUS, and α-synuclein. Here, we describe this optimized protocol, which could be adapted to screen libraries constructed using any protein backbone for suppression of toxicity of any protein that is toxic in yeast.
Introduction
המודלים proteinopathy השמרים פותחו לטיפול בהפרעות misfolding חלבון כוללים מחלת ניוון (ALS) ופרקינסון (PD) 1-3. ביטוי של החלבונים TDP-43 וFUS, שmisfold בחולי ALS, הם רעיל וmislocalize כדי ליצור אגרגטים cytoplasmic בשמרים 1,2. בדומה לכך, הביטוי של α-סינוקלאין (α-SYN), אשר היה מעורב בPD, הוא רעיל וmislocalizes כדי ליצור אגרגטים cytoplasmic בשמרים 3. תכונות אלה לשחזר פנוטיפים בחולים עם הפרעות אלה 4,5. כך, שמרי מודלים לספק פלטפורמה שימושית עבור בדיקות סקר לאיתור חלבונים או מולקולות קטנות המונעים או הפוך פנוטיפים אלה 2,6-13. אנו מעוניינים בפיתוח של חלבונים המסוגלים היפוך צבירה ורעילות בשל TDP-43, FUS, וα-syn. אנו מתמקדים בHsp104, AAA + חלבון משמרים כי הוא מסוגל ריסוק חלבונים ייחודי הן frאגרגטים אום אמורפי ועמילואיד בשמרים, אך אין לה homologue אדם 14,15. Hsp104 רגיש ועדין לdisaggregate פריונים שמרי אנדוגני ויש לו רק יכולת מוגבלת disaggregate מצעים המעורבים במחלות ניווניות אנושיות, שזה אף פעם לא נתקל בדרך 16,17. כך, אנו שואפים להנדס גרסאות משופרות של Hsp104 כי הם מסוגלים disaggregate efficaciously מצעים האנושיים אלה. לשם כך, אנו בונים ספריות גדולות של Hsp104 גרסאות באמצעות PCR ומועד לשגיאות; יכולות להיות מוקרנת ספריות אלה באמצעות המודלים השמרים proteinopathy 17. אנחנו אימצנו גישה ממוקדת-תחום לבניית וסינון ספריות, כHsp104 הוא גדול מאוד 17. אנחנו בתחילה התמקדנו בתחום ביניים (MD) של Hsp104 17, אם כי יכולים להיות מועסקות גישות דומות לדומיינים אחרים. מודלים אלה מאפשרים בדיקות סקר לאיתור פעילות Disaggregase ישירות, בניגוד לטכניקות חלופיות כגון תצוגה לפני שטח, ושארricted להשתמש לניטור מחייב 18.
הפרוטוקול שלנו מבוסס על שני שלבי סינון (איור 1). ראשית, גרסאות Hsp104 המדכאות את הרעילות של מצע המחלה בשמרים נבחרות. לשם כך, Hsp104 גרסאות ו- קשור מחלה מצעם cotransformed לשמרי Hsp104 Δ. אנו מעסיקים שמרי Hsp104 Δ ללחקור את חלל רצף Hsp104 בהעדר wild-type (WT) Hsp104 17. חשוב לציין, מחיקה של Hsp104 אינה משפיעה על α-syn, FUS, או TDP-43 רעילות בשמרים, וביטוי של Hsp104 WT מספק הצלה מינימאלית 1,13,17. השמרים אז מצופים על גרימת תקשורת כדי לגרום לביטוי של שני החלבונים. שמרים מחסה גרסאות Hsp104 המדכאות רעילות של הצמיחה מקנה המצע הקשורים למחלות של המושבה. גרסאות אלו נבחרו לניתוח נוסף, בעוד שמושבות שמירת גרסאות שאינו לדכא למות רעילות. עם זאת,תוצאות חיוביות שגויות הן בעיה משמעותית במסך זה. הביטוי של TDP-43, FUS, וα-syn הוא רעיל ביותר, אשר יוצר לחץ סלקטיבי חזק להופעתו של מדכאי גנטיים ספונטניים של רעילות שאינה קשורה לגרסת Hsp104 לידי ביטוי. כך, יש לנו להשתמש במסך משני שהוא גם גבוהה יחסית תפוקה לחסל מדכאי רעילות ספציפיים אלה 17. במסך המשני זו, מטופלים שמרים נבחרים עם 5-Fluorootic חומצה (5-פואה) כדי להתמודד בחר לפלסמיד Hsp104 19. אז הזנים נבחנים לגבי מצע רעילות (TDP-43, FUS, או α-SYN) באמצעות איתור assay כדי להבטיח שהרעילות של המצע משוחזרת לאחר אובדן פלסמיד Hsp104. כך, שמרים שברעילות משוחזרת במסך משני זה כנראה שבעבר הוצגו דיכוי רעילות בשל נוכחותם של גרסת Hsp104. השמרים הללו מיועדים 'להיטים' ופלסמיד Hsp104 צריך להיות אזהתאושש ורצף לזהות מוטציות בגן Hsp104 17 (איור 1). כל להיטים אז צריכים להיות אושר על ידי בניית המוטציה באופן עצמאי באמצעות מוטגנזה מכוונת ולאחר מכן בדיקה חוזרת לדיכוי רעילות. היישומים האפשריים עבור פרוטוקול זה הם רחבים. שימוש בשיטות אלה, ספריות מכל סוג של חלבון יכולות להיות מוקרנת לגרסות המדכאות רעילות של כל חלבון מצע כי הוא רעיל בשמרים.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן אנו מציגים את הגישה שלנו לבידוד גרסאות Hsp104 potentiated המדכאות את הרעילות של מצעים הקשורים למחלות באמצעות מודלים השמרים proteinopathy. שימוש בגישה זו, ספריות גדולות של גרסאות יכולות להיות מוקרנת בתפוקה גבוהה, עם המגבלה היחידה להיות מספר הגרסאות שעוברות מסך המשני 5-פואה. על י?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Sue Lindquist, Aaron Gitler, and Martin Duennwald for kindly sharing reagents. Our studies were supported by: an American Heart Association Post-Doctoral Fellowship (M.E.J); NIH Director’s New Innovator Award DP2OD002177, NIH grants R21NS067354, R21HD074510, and R01GM099836, a Muscular Dystrophy Association Research Award (MDA277268), Packard Center for ALS Research at Johns Hopkins University, Target ALS, and an Ellison Medical Foundation New Scholar in Aging Award (J.S.).
Materials
| Table of Specific Materials/Equipment | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GeneMorphII EZClone Domain Mutagenesis Kit | Agilent | 200552 | |
| 150mm Petri dishes | Falcon | 351058 | |
| 5-Fluorootic Acid | Research Products International | f10501-5.0 | |
| 96-DeepWell 2mL Plates | Eppendorf | 0030 502.302 | |
| 96 bold replicator tool | V&P Scientific | vp-404 | |
| ExoSAP-IT | Affymetrix | 78200 |
References
- Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. A yeast TDP-43 proteinopathy model: Exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (17), 6439-6444 (2008).
- Sun, Z., et al. Molecular Determinants and Genetic Modifiers of Aggregation and Toxicity for the ALS Disease Protein FUS/TLS. PLoS Biol. 9 (4), (2011).
- Outeiro, T. F., Lindquist, S. Yeast Cells Provide Insight into Alpha-Synuclein Biology and Pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).
- Forman, M. S., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. Neurodegenerative diseases: a decade of discoveries paves the way for therapeutic breakthroughs. Nat Med. 10 (10), 1055-1063 (2004).
- Morimoto, R. I. Stress, aging, and neurodegenerative disease. N Engl J Med. 355 (21), 2254-2255 (2006).
- Elden, A. C., et al. Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS. Nature. 466 (7310), 1069-1075 (2010).
- Cooper, A. A., et al. Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson’s models. Science. 313 (5785), 324-328 (2006).
- Gitler, A. D., et al. Alpha-synuclein is part of a diverse and highly conserved interaction network that includes PARK9 and manganese toxicity. Nature genetics. 41 (3), 308-315 (2009).
- Su, L. J., et al. Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson’s disease models. Disease models & mechanisms. (3-4), 194-208 (2010).
- Tardiff, D. F., et al. Yeast reveal a ‘druggable’ Rsp5/Nedd4 network that ameliorates alpha-synuclein toxicity in neurons. Science. 342 (6161), 979-983 (2013).
- Tardiff, D. F., Tucci, M. L., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A., Lindquist, S. Different 8-hydroxyquinolines protect models of TDP-43 protein, alpha-synuclein, and polyglutamine proteotoxicity through distinct mechanisms. The Journal of biological chemistry. 287 (6), 4107-4120 (2012).
- Kim, H. J., et al. Therapeutic modulation of eIF2alpha phosphorylation rescues TDP-43 toxicity in amyotrophic lateral sclerosis disease models. Nature. 46 (2), 152-160 (2014).
- Ju, S., et al. A yeast model of FUS/TLS-dependent cytotoxicity. PLoS Biol. 9 (4), (2011).
- Shorter, J. Hsp104: a weapon to combat diverse neurodegenerative disorders. Neurosignals. 16 (1), 63-74 (2008).
- Vashist, S., Cushman, M., Shorter, J. Applying Hsp104 to protein-misfolding disorders. Biochem Cell Biol. 88 (1), 1-13 (2010).
- DeSantis, M. E., et al. Operational Plasticity Enables Hsp104 to Disaggregate Diverse Amyloid and Nonamyloid Clients. Cell. 151 (4), 778-793 (2012).
- Jackrel, M. E., et al. Potentiated Hsp104 Variants Antagonize Diverse Proteotoxic Misfolding Events. Cell. 156 (1-2), 170-182 (2014).
- Wittrup, K. D., Verdine, G. L., Wittrup, K. D., Verdine, G. L. . Methods in Enzymology. 503, 13-14 (2012).
- Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. R. . Methods in Enzymology. 154, 164-175 (1987).
- Miyazaki, K. Creating Random Mutagenesis Libraries by Megaprimer PCR of Whole Plasmid (MEGAWHOP). Directed Evolution Library Creation: Methods in Molecular Biology. eds FrancesH Arnold & George Georgiou. 231, 23-28 (2003).
- Saibil, H. Chaperone machines for protein folding, unfolding and disaggregation. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (10), 630-642 (2013).
- Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat. Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
- Armakola, M., Hart, M. P., Gitler, A. D. TDP-43 toxicity in yeast. Methods. 53 (3), 238-245 (2011).
- Alberti, S., Gitler, A. D., Lindquist, S. A suite of Gateway® cloning vectors for high-throughput genetic analysis in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 24 (10), 913-919 (2007).
