Isoleren versterkt Hsp104 Varianten Met behulp Gist proteïnopathie Modellen

Summary

Yeast proteinopathy models are valuable tools to assess the toxicity and aggregation of proteins implicated in disease. Here, we present methods for screening Hsp104 variant libraries for toxicity suppressors. This protocol could be adapted to screen any protein library for toxicity suppressors of any protein that is toxic in yeast.

Abstract

Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic lateral sclerosis, and α-synuclein, implicated in Parkinson’s disease, are toxic and form cytoplasmic aggregates in yeast. These features recapitulate protein pathologies observed in patients with these disorders. Thus, yeast are an ideal platform for isolating toxicity suppressors from libraries of protein variants. We are interested in applying protein disaggregases to eliminate misfolded toxic protein conformers. Specifically, we are engineering Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast that is uniquely capable of solubilizing both disordered aggregates and amyloid and returning the proteins to their native conformations. While Hsp104 is highly conserved in eukaryotes and eubacteria, it has no known metazoan homologue. Hsp104 has only limited ability to eliminate disordered aggregates and amyloid fibers implicated in human disease. Thus, we aim to engineer Hsp104 variants to reverse the protein misfolding implicated in neurodegenerative disorders. We have developed methods to screen large libraries of Hsp104 variants for suppression of proteotoxicity in yeast. As yeast are prone to spontaneous nonspecific suppression of toxicity, a two-step screening process has been developed to eliminate false positives. Using these methods, we have identified a series of potentiated Hsp104 variants that potently suppress the toxicity and aggregation of TDP-43, FUS, and α-synuclein. Here, we describe this optimized protocol, which could be adapted to screen libraries constructed using any protein backbone for suppression of toxicity of any protein that is toxic in yeast.

Introduction

Gist proteïnopathie modellen ontwikkeld voor eiwit misfolding aandoeningen zoals amyotrofe laterale sclerose (ALS) en de ziekte (PD) ^1-3 Parkinson. Expressie van de eiwitten TDP-43 en FUS, die misfold bij ALS-patiënten, zijn giftig en mislocalize om cytoplasmatische aggregaten in gist ^1,2. Evenzo expressie van α-synucleïne (α-syn), die betrokken is bij PD, giftig en mislocalizes cytoplasmatische aggregaten in gist ^3. Deze functies recapituleren fenotypen bij patiënten met deze aandoeningen ^4,5. Zo gistmodellen een nuttig platform voor het screenen voor eiwitten of kleine moleculen die voorkomen of reverse deze fenotypes ^2,6-13. We geïnteresseerd in de ontwikkeling van eiwitten die in staat omkeren aggregatie en toxiciteit door TDP-43, FUS en α-syn zijn. Wij richten ons op Hsp104, een AAA + eiwit uit gist die uniek is in staat disaggregerende eiwitten zowel frOM amorfe aggregaten en amyloid in gist, maar het heeft geen menselijke homoloog ^14,15. Hsp104 is volledig afgestemd op endogene gist prionen disaggregeren en heeft slechts een beperkte capaciteit om substraten betrokken bij de menselijke neurodegeneratieve ziekten, die het nooit normaal tegenkomt ^16,17 disaggregeren. Zo streven we naar verbeterde versies van Hsp104 die in staat zijn om krachtdadig disaggregeren deze menselijke substraten zijn ingenieur. Om dit te doen, bouwen we grote bibliotheken van Hsp104 varianten met behulp van fouten gevoelige PCR; Deze bibliotheken kunnen worden gescreend met de gist proteïnopathie modellen ^17. We hebben een op een domein gerichte aanpak van de bouw en het screenen van bibliotheken aangenomen, als Hsp104 is zeer groot ^17. We richtte zich op de middelste domein (MD) van Hsp104 ^17, hoewel soortgelijke benaderingen kunnen worden gebruikt om andere domeinen screenen. Deze modellen stellen screening disaggregase activiteit direct tegenover alternatieve technieken zoals oppervlakte vertoning, die rustricted te gebruiken voor het bewaken binding ^18.

Ons protocol is gebaseerd op twee stappen screening (figuur 1). Eerst, Hsp104 varianten die de toxiciteit van de ziekte substraat in gist onderdrukken geselecteerd. Om dit te doen, de Hsp104 varianten en de ziekte-geassocieerde substraat worden gecotransformeerd in Δ Hsp104 gist. We maken gebruik van Δ Hsp104 gist Hsp104 sequence ruimte verkennen in de afwezigheid van wild-type (WT) Hsp104 ^17. Belangrijk is, betekent verwijdering van Hsp104 geen invloed op α-syn, FUS, of TDP-43 toxiciteit in gist, en expressie van Hsp104 ^WT geeft minimaal rescue ^1,13,17. De gist wordt daarna uitgeplaat op media induceren van expressie van beide eiwitten te induceren. Gist herbergen Hsp104 varianten die toxiciteit van de ziekte-geassocieerde substraat conferentiedeelnemers groei van de kolonie te onderdrukken. Deze varianten worden geselecteerd voor verdere analyse, terwijl kolonies behoud varianten die geen toxiciteit sterven onderdrukken. Echter,valse positieven zijn een substantieel probleem in dit scherm. Expressie van TDP-43, FUS en α-syn zeer giftig, die een sterke selectieve druk voor het optreden van spontane genetische suppressors van toxiciteit verbonden aan de Hsp104 variant gemaakt worden uitgedrukt. Aldus hebben we een tweede scherm dat relatief hoge doorzet deze niet-specifieke toxiciteit suppressors ¹⁷ elimineren gebruikt. In dit tweede scherm, worden geselecteerd gist behandeld met 5-Fluorootic Acid (5-FOA) selecteren voor de Hsp104 plasmide ¹⁹ tegen te gaan. De stammen worden vervolgens beoordeeld op het substraat (TDP-43, FUS of α-syn) toxiciteit via spotten assay dat de toxiciteit van het substraat is hersteld na verlies van de Hsp104 plasmide. Zo gist waarbij toxiciteit wordt hersteld in de secundaire screening vermoedelijk oorspronkelijk weergegeven toxiciteit onderdrukking door de aanwezigheid van de Hsp104 variant. Deze gist zijn aangewezen als 'hits' en de Hsp104 plasmide moet danhersteld en gesequenced om de mutaties in het gen Hsp104 ¹⁷ (figuur 1) geeft. Eventuele treffers dan bevestigd door het construeren van de mutatie onafhankelijk Via plaatsgerichte mutagenese en vervolgens opnieuw testen op toxiciteit onderdrukking. De mogelijke toepassingen voor dit protocol zijn breed. Met deze methoden kunnen bibliotheken van elk type proteïne worden gescreend op varianten die toxiciteit van substraat eiwit dat giftig in gist onderdrukken.

Protocol

1. Bibliotheek Generation Om bibliotheken van Hsp104 behulp domeinspecifieke fouten gevoelige PCR construeren, eerst het domein van belang met een foutgevoelige DNA polymerase 20 versterken. Zuiver het PCR product door gel extractie. Voer een megaprimer extensie stap met een standaard plaatsgerichte mutagenese protocol: combineer 50 ng matrijs plasmide, 250 ng megaprimer, 200 uM dNTP's, en high-fidelity DNA polymerase in PCR buffer, en verdun tot 50 ui totaal volume met PCR …

Representative Results

We hebben een bibliotheek van Hsp104 varianten gerandomiseerd in het midden domein geconstrueerd en gescreend is voor onderdrukking van TDP-43 toxiciteit. De bibliotheek werd getransformeerd en uitgeplaat op glucose en galactose platen (figuur 2) om de stringentie van het scherm beoordelen. Enkele kolonies werden geselecteerd en de stammen werden geselecteerd teller met 5-FOA de Hsp104 plasmide elimineren. Deze stammen werden vervolgens beoordeeld dat citeit was door TDP-43 alleen, zonder Hsp104 variant…

Discussion

Hier presenteren we onze benadering isoleren gepotentieerd Hsp104 varianten die de toxiciteit van ziekte- geassocieerde substraten met gist proteïnopathie modellen onderdrukken. Met deze benadering kunnen grote bibliotheken van varianten worden gescreend in high throughput, met als enige beperking dat het aantal varianten dat het secundaire scherm 5-FOA passen. Door deze stappen in 96 putjes, routinematig screenen we tot 200 treffers tegelijk in de 5-FOA stappen in de loop van 1-2 weken. Het aantal hits verkregen bij d…

Materials

Table of Specific Materials/Equipment
Name	Company	Catalog Number	Comments
GeneMorphII EZClone Domain Mutagenesis Kit	Agilent	200552
150mm Petri dishes	Falcon	351058
5-Fluorootic Acid	Research Products International	f10501-5.0
96-DeepWell 2mL Plates	Eppendorf	0030 502.302
96 bold replicator tool	V&P Scientific	vp-404
ExoSAP-IT	Affymetrix	78200