Isolieren Potenzierte Hsp104 Varianten unter Verwendung von Hefe Proteinopathy Models

Summary

Yeast proteinopathy models are valuable tools to assess the toxicity and aggregation of proteins implicated in disease. Here, we present methods for screening Hsp104 variant libraries for toxicity suppressors. This protocol could be adapted to screen any protein library for toxicity suppressors of any protein that is toxic in yeast.

Abstract

Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic lateral sclerosis, and α-synuclein, implicated in Parkinson’s disease, are toxic and form cytoplasmic aggregates in yeast. These features recapitulate protein pathologies observed in patients with these disorders. Thus, yeast are an ideal platform for isolating toxicity suppressors from libraries of protein variants. We are interested in applying protein disaggregases to eliminate misfolded toxic protein conformers. Specifically, we are engineering Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast that is uniquely capable of solubilizing both disordered aggregates and amyloid and returning the proteins to their native conformations. While Hsp104 is highly conserved in eukaryotes and eubacteria, it has no known metazoan homologue. Hsp104 has only limited ability to eliminate disordered aggregates and amyloid fibers implicated in human disease. Thus, we aim to engineer Hsp104 variants to reverse the protein misfolding implicated in neurodegenerative disorders. We have developed methods to screen large libraries of Hsp104 variants for suppression of proteotoxicity in yeast. As yeast are prone to spontaneous nonspecific suppression of toxicity, a two-step screening process has been developed to eliminate false positives. Using these methods, we have identified a series of potentiated Hsp104 variants that potently suppress the toxicity and aggregation of TDP-43, FUS, and α-synuclein. Here, we describe this optimized protocol, which could be adapted to screen libraries constructed using any protein backbone for suppression of toxicity of any protein that is toxic in yeast.

Introduction

Hefe proteinopathy Modelle wurden für Proteinfehlfaltung Störungen, einschließlich amyotropher Lateralsklerose (ALS) und Parkinson-Krankheit (PD) ^1-3 entwickelt. Expression der Proteine ​​TDP-43 und FUS, die in ALS-Patienten misfold, sind toxisch und mislocalize cytoplasmatischen Aggregaten in Hefe ^1,2 bilden. Ebenso Expression von α-Synuclein (α-syn), die in PD gebracht wird, ist toxisch und mislocalizes cytoplasmatischen Aggregaten in Hefe ³ zu bilden. Diese Merkmale rekapitulieren Phänotypen bei Patienten mit diesen Erkrankungen ^4,5. So, Hefe-Modelle bieten eine nützliche Plattform für das Screening für Proteine ​​oder kleine Moleküle, die verhindern oder rückgängig diese Phänotypen ^2,6-13. Wir interessieren uns für die Entwicklung von Proteinen, die in der Lage umzukehren Aggregation und Toxizität durch TDP-43, FUS und α-syn sind. Wir konzentrieren uns auf Hsp104, ein AAA + Protein aus Hefe, die einzigartig in der Lage Disaggregieren Proteine ​​sowohl fr istom amorphen Aggregaten und Amyloid in Hefe, es hat noch keine menschliche Homolog ^14,15. Hsp104 fein abgestimmt, um endogene Hefe Prionen zerlegen und hat nur begrenzte Fähigkeit, Substrate in menschlichen neurodegenerativen Erkrankungen in Verbindung gebracht, die es nie gewöhnlich begegnet ^16,17 zerlegen. So wollen wir verbesserte Versionen von Hsp104, die in der Lage, wirksam zu zerlegen diese menschlichen Substrate sind Ingenieur. Dazu konstruieren wir große Bibliotheken Hsp104 Varianten mit fehleranfällige PCR; Diese Bibliotheken können mit den Hefe proteinopathy Modelle ¹⁷ zu sehen sein. Wir haben eine Domain-bezogenen Ansatz zur Konstruktion und Screening-Bibliotheken angenommen, wie Hsp104 ist sehr groß ^17. Wir konzentrierte sich zunächst auf die Mitteldomäne (MD) von Hsp104 ^17, obwohl ähnliche Ansätze können verwendet werden, um andere Bereiche zu screenen. Diese Modelle ermöglichen für disaggregase Aktivität direkt Screening, im Gegensatz zu alternativen Techniken wie Oberflächen Display, das andere istricted zur Überwachung Bindungs ^​​18 verwenden.

Unser Protokoll auf zwei Screeningschritte (Abbildung 1). Zunächst werden Hsp104-Varianten, die die Toxizität der Krankheit Substrat in Hefe unterdrücken, ausgewählt ist. Um dies zu tun, Varianten der Hsp104 und krankheitsassoziierten Substrat in Δ hsp104 Hefe kotransformiert. Wir beschäftigen Δ hsp104 Hefe Hsp104 Sequenzraum in Abwesenheit von Wildtyp (WT) Hsp104 ¹⁷ zu erkunden. Wichtig ist, dass das Löschen von Hsp104 nicht beeinträchtigt α-syn, FUS oder TDP-43 Toxizität in Hefe und die Expression von Hsp104 ^WT eine minimale Rettungs ^1,13,17. Die Hefe wird dann auf induzierenden Medium, um die Expression der beiden Proteine ​​induzieren plattiert. Hefe beherbergen Hsp104 Varianten Toxizität der Krankheit assoziierten Substrat confer Wachstum der Kolonie zu unterdrücken. Diese Varianten werden zur weiteren Analyse ausgewählt, während Kolonien aufrechterhalten Varianten, die Toxizität sterben nicht unterdrücken müssen. JedochFehlalarme sind ein wesentliches Problem in diesem Bildschirm. Expression des TDP-43, FUS und α-syn hoch toxisch, was einen starken Selektionsdruck für das Auftreten von spontanen genetischen Suppressoren der Toxizität nicht mit dem Hsp104 Variante erstellt exprimiert. Somit haben wir einen zweiten Bildschirm, der auch relativ hohen Durchsatz, diese unspezifischen Toxizität Drücker ¹⁷ zu eliminieren. In diesem zweiten Bildschirm werden ausgewählte Hefe mit 5-Fluorootic Säure (5-FOA) behandelt, um entgegenzuwirken Select für den Hsp104 Plasmid ^19. Die Stämme werden dann auf Substrat (TDP-43, FUS oder α-syn) Toxizität gegen Fleckentest, um sicherzustellen, dass die Toxizität des Substrats nach dem Verlust des Hsp104 Plasmid wieder bewertet. Somit Hefe toxisch ist in diesem Sekundärbild wiederhergestellt vermutlich ursprünglich angezeigte Toxizität Unterdrückung aufgrund der Anwesenheit des Hsp104-Variante. Diese Hefe werden als "Hits" bezeichnet, und die Hsp104 Plasmid sollte danngewonnen und sequenziert, um die Mutationen in der Hsp104-Gens ¹⁷ (Figur 1) zu identifizieren. Alle Treffer soll dann durch den Bau die Mutation unabhängig unter Verwendung ortsgerichtete Mutagenese und dann erneute Prüfung auf Toxizität Unterdrückung rückbestätigt werden. Die Anwendungsmöglichkeiten für dieses Protokoll sind breit. Mit Hilfe dieser Methoden können Bibliotheken von jeder Art von Proteinvarianten, die zur Toxizität von jedem Substrat Protein, das in Hefe toxisch ist drücken gescreent werden.

Protocol

1. Herstellung von Bibliotheken Um Bibliotheken von Hsp104 mit domänenspezifischen fehleranfällige PCR konstruieren zunächst verstärken die Domäne von Interesse mit einem fehleranfälligen DNA-Polymerase 20. Reinige den PCR-Produkt durch Gel-Extraktion. Führen Megaprimer-Extensionsschritt unter Verwendung einer Standardortsgerichtete Mutagenese-Protokoll: Kombinieren 50 ng Templat-Plasmid, 250 ng Megaprimer, 200 uM dNTPs und High-Fidelity-DNA-Polymerase in PCR-Puffer, und …

Representative Results

Wir haben eine Bibliothek von Hsp104 Varianten in der Mitteldomäne randomisiert konstruiert und gesiebt es zur Unterdrückung von TDP-43 Toxizität. Die Bibliothek wurde transformiert und auf Glucose und Galactose-Platten (2) überzogen, um die Stringenz der Bildschirm zu bewerten. Einzelne Kolonien wurden ausgewählt und die Stämme wurden Zähler mit 5-FOA die Hsp104 Plasmid beseitigen ausgewählt. Diese Stämme wurden dann bewertet, diese Toxizität zu bestätigen war auf TDP-43 allein, ohne den Hsp…

Discussion

Hier präsentieren wir unseren Ansatz zur Isolierung potenziert Hsp104-Varianten, die die Toxizität von krankheitsassoziierten Substraten unter Verwendung von Hefe proteinopathy Modelle zu unterdrücken. Mit diesem Ansatz können große Bibliotheken von Varianten im Hochdurchsatz untersucht werden, wobei die einzige Einschränkung ist die Anzahl der Varianten, die das 5-FOA sekundären Sieb passieren. Durch Durchführen dieser Schritte in 96-Well-Format, routinemäßig auf die wir bis zu 200 Zugriffe zu einem Zeitpunkt…

Materials

Table of Specific Materials/Equipment
Name	Company	Catalog Number	Comments
GeneMorphII EZClone Domain Mutagenesis Kit	Agilent	200552
150mm Petri dishes	Falcon	351058
5-Fluorootic Acid	Research Products International	f10501-5.0
96-DeepWell 2mL Plates	Eppendorf	0030 502.302
96 bold replicator tool	V&P Scientific	vp-404
ExoSAP-IT	Affymetrix	78200