Kuvvetlendiği Hsp104 Varyantlar kullanarak Maya Proteinopathy Modelleri Ayırma
Summary
Yeast proteinopathy models are valuable tools to assess the toxicity and aggregation of proteins implicated in disease. Here, we present methods for screening Hsp104 variant libraries for toxicity suppressors. This protocol could be adapted to screen any protein library for toxicity suppressors of any protein that is toxic in yeast.
Abstract
Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic lateral sclerosis, and α-synuclein, implicated in Parkinson’s disease, are toxic and form cytoplasmic aggregates in yeast. These features recapitulate protein pathologies observed in patients with these disorders. Thus, yeast are an ideal platform for isolating toxicity suppressors from libraries of protein variants. We are interested in applying protein disaggregases to eliminate misfolded toxic protein conformers. Specifically, we are engineering Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast that is uniquely capable of solubilizing both disordered aggregates and amyloid and returning the proteins to their native conformations. While Hsp104 is highly conserved in eukaryotes and eubacteria, it has no known metazoan homologue. Hsp104 has only limited ability to eliminate disordered aggregates and amyloid fibers implicated in human disease. Thus, we aim to engineer Hsp104 variants to reverse the protein misfolding implicated in neurodegenerative disorders. We have developed methods to screen large libraries of Hsp104 variants for suppression of proteotoxicity in yeast. As yeast are prone to spontaneous nonspecific suppression of toxicity, a two-step screening process has been developed to eliminate false positives. Using these methods, we have identified a series of potentiated Hsp104 variants that potently suppress the toxicity and aggregation of TDP-43, FUS, and α-synuclein. Here, we describe this optimized protocol, which could be adapted to screen libraries constructed using any protein backbone for suppression of toxicity of any protein that is toxic in yeast.
Introduction
Maya proteinopathy modeller amiyotrofik lateral skleroz (ALS) ve Parkinson hastalığı (PD) 1-3 içeren protein-yanlış katlanması bozuklukları için geliştirilmiştir. ALS hastalarında misfold protein TDP-43 ve FUS sentezlenmesi, maya 1,2 sitoplazmik agregatlar oluşturması için zehirli ve mislocalize bulunmaktadır. Benzer şekilde, PD karıştığı α-sinüklein (α-sin), ekspresyonu, toksik ve mislocalizes maya 3 sitoplazmik eden agregalar meydana getirir. Bu özellikler bu bozuklukların 4,5 olan hastalarda fenotipleri özetlemek. Bu nedenle, maya modelleri önlemek ya da bu fenotipleri 2,6-13 ters proteinler ya da küçük moleküllerin taranmasına yönelik yararlı bir platform sağlar. Biz nedeniyle TDP-43, FUS ve α-syn için toplanmasını ve toksisite geri yeteneğine sahip proteinlerin geliştirilmesinde ilgilendi. Biz Hsp104, hem fr proteinleri ayırmak olma eşsiz yeteneği olan mayadan AAA + protein odaklanmakmayada om amorf agrega ve amiloid, henüz hiçbir insan homolojunu 14,15 sahiptir. Hsp104 ince endojen maya prionları parçalamak için ayarlanmış ve normalde 16,17 karşılaştığında asla insan nörodejeneratif hastalıklarda rol yüzeylerde, parçalamak için sadece sınırlı bir yeteneği vardır. Böylece, biz birebir bu insan substratları ayrıştırmak mümkün Hsp104 gelişmiş versiyonlarını mühendisi hedefliyoruz. Hsp104 hata eğilimli PCR kullanarak varyantları Bunu yapmak için, biz büyük kütüphaneler inşa; bu kütüphaneler maya proteinopathy modelleri 17 kullanılarak taranabilir. Hsp104 17 çok büyük olduğu gibi biz, kütüphaneler oluşturmak ve tarama için bir etki alanı hedefli bir yaklaşım benimsemiştir. Benzer yaklaşımlar diğer etki taranması için kullanılabilecek olsa biz başlangıçta, orta etki Hsp104 17 (MD) odaklanmıştır. Bu tür geri kalanı yüzey gösterimi gibi alternatif teknikler karşıt olarak bu modeller, doğrudan Disaggregase aktivitesi için elenmesini sağlamak18 bağlama izlenmesi için kullanılacak ricted.
Bizim protokol iki tarama aşaması (Şekil 1) dayanmaktadır. İlk olarak, mayada hastalık substratın toksisitesi bastırmak Hsp104 varyantları seçilir. Bunu yapmak için, Hsp104 varyantları ve hastalıkla ilişkili alt-tabaka Δ hsp104 maya içine ortak transforme edilir. Biz, vahşi tip yokluğunda (WT) Hsp104 17 Hsp104 dizisi alan araştırmak Δ hsp104 maya kullanılmaktadır. Önemlisi, Hsp104 silinmesi mayada α-sin, FUs, ya da TDP-43 toksisite etkilemez, ve Hsp104 WT ifadesi minimum kurtarma 1,13,17 sağlar. Maya her iki proteinlerin sentezlenmesinin uyarılması için ortam uyarılması üzerine yerleştirilir. Koloninin hastalıkla ilişkili substrat bahşedebilir büyüme toksisitesi bastırmak Hsp104 varyantlarını barındıran maya. Koloniler toksisite kalıbı bastıramaz varyantlarını korurken, bu varyantlar, daha fazla analiz için seçilmiştir. Bununla birlikte,yanlış pozitif Bu ekranda önemli bir sorun vardır. TDP-43, FUS ve α-syn sentezlenmesi ifade edilir Hsp104 varyant olmayan toksisite kendiliğinden genetik bastırma ortaya çıkması için güçlü bir seçici basınç oluşturur, oldukça zehirlidir. Bu nedenle, biz ayrıca spesifik olmayan toksisite bastırıcılar 17 ortadan kaldırmak için, nispeten yüksek miktarda olan ikincil bir ekran kullanmaktadır. Bu ikincil bir tarama, seçilen maya Hsp104 plazmidin 19 seçme karşı 5-Fluorootic asit (5-FOA) ile muamele edilir. Soy daha sonra alt-tabakanın toksisite Hsp104 plazmidin kaybından sonra geri sağlamak için tahlil lekelenme ile (TDP-43, FUS ya da α-sin) toksisite alt-tabaka açısından değerlendirilir. Bu nedenle, toksisitesi bu ikinci ekranda geri edildiği maya muhtemelen başlangıçta bağlı Hsp104 varyantın varlığını toksisite bastırma gösterilir. Bu maya "sonuç" olarak adlandırılan ve Hsp104 plazmid daha sonra olmalıdırgeri kazanılmış ve Hsp104 gen 17 (Şekil 1) 'de başkalaşımların teşhis edilmesi için dizilenmiştir. Herhangi bir hitleri daha sonra toksisite bastırılması için yeniden test daha sonra bağımsız bir şekilde mutasyona inşa yer yönlendirmeli mutajenezi kullanarak ve teyit edilmelidir. Bu protokol için potansiyel uygulamalar geniştir. Bu yöntemler kullanılarak, protein herhangi bir tür kütüphaneleri maya içinde toksik olan herhangi bir alt tabaka proteininin toksisitesi bastırmak varyantlar için taranabilir olabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada maya proteinopathy modellerini kullanarak hastalıkla ilişkili alt tabakaların toksisitesi bastırmak potansiyelize Hsp104 varyantları izole bizim yaklaşım sunmak. Bu yaklaşımı kullanarak, varyantlarının büyük kütüphanelerin, tek sınırlandırma, 5-FOA İkinci ekrana geçmek varyantları sayı olmak üzere, yüksek bir verimlilik de taranabilir. 96 kuyu formatında bu adımları gerçekleştirerek, rutin 1-2 hafta boyunca 5-FOA aşamasında bir anda 200 hit kadar ekran. Ilk tarama aşaması esnası…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Sue Lindquist, Aaron Gitler, and Martin Duennwald for kindly sharing reagents. Our studies were supported by: an American Heart Association Post-Doctoral Fellowship (M.E.J); NIH Director’s New Innovator Award DP2OD002177, NIH grants R21NS067354, R21HD074510, and R01GM099836, a Muscular Dystrophy Association Research Award (MDA277268), Packard Center for ALS Research at Johns Hopkins University, Target ALS, and an Ellison Medical Foundation New Scholar in Aging Award (J.S.).
Materials
| Table of Specific Materials/Equipment | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GeneMorphII EZClone Domain Mutagenesis Kit | Agilent | 200552 | |
| 150mm Petri dishes | Falcon | 351058 | |
| 5-Fluorootic Acid | Research Products International | f10501-5.0 | |
| 96-DeepWell 2mL Plates | Eppendorf | 0030 502.302 | |
| 96 bold replicator tool | V&P Scientific | vp-404 | |
| ExoSAP-IT | Affymetrix | 78200 |
References
- Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. A yeast TDP-43 proteinopathy model: Exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (17), 6439-6444 (2008).
- Sun, Z., et al. Molecular Determinants and Genetic Modifiers of Aggregation and Toxicity for the ALS Disease Protein FUS/TLS. PLoS Biol. 9 (4), (2011).
- Outeiro, T. F., Lindquist, S. Yeast Cells Provide Insight into Alpha-Synuclein Biology and Pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).
- Forman, M. S., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. Neurodegenerative diseases: a decade of discoveries paves the way for therapeutic breakthroughs. Nat Med. 10 (10), 1055-1063 (2004).
- Morimoto, R. I. Stress, aging, and neurodegenerative disease. N Engl J Med. 355 (21), 2254-2255 (2006).
- Elden, A. C., et al. Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS. Nature. 466 (7310), 1069-1075 (2010).
- Cooper, A. A., et al. Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson’s models. Science. 313 (5785), 324-328 (2006).
- Gitler, A. D., et al. Alpha-synuclein is part of a diverse and highly conserved interaction network that includes PARK9 and manganese toxicity. Nature genetics. 41 (3), 308-315 (2009).
- Su, L. J., et al. Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson’s disease models. Disease models & mechanisms. (3-4), 194-208 (2010).
- Tardiff, D. F., et al. Yeast reveal a ‘druggable’ Rsp5/Nedd4 network that ameliorates alpha-synuclein toxicity in neurons. Science. 342 (6161), 979-983 (2013).
- Tardiff, D. F., Tucci, M. L., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A., Lindquist, S. Different 8-hydroxyquinolines protect models of TDP-43 protein, alpha-synuclein, and polyglutamine proteotoxicity through distinct mechanisms. The Journal of biological chemistry. 287 (6), 4107-4120 (2012).
- Kim, H. J., et al. Therapeutic modulation of eIF2alpha phosphorylation rescues TDP-43 toxicity in amyotrophic lateral sclerosis disease models. Nature. 46 (2), 152-160 (2014).
- Ju, S., et al. A yeast model of FUS/TLS-dependent cytotoxicity. PLoS Biol. 9 (4), (2011).
- Shorter, J. Hsp104: a weapon to combat diverse neurodegenerative disorders. Neurosignals. 16 (1), 63-74 (2008).
- Vashist, S., Cushman, M., Shorter, J. Applying Hsp104 to protein-misfolding disorders. Biochem Cell Biol. 88 (1), 1-13 (2010).
- DeSantis, M. E., et al. Operational Plasticity Enables Hsp104 to Disaggregate Diverse Amyloid and Nonamyloid Clients. Cell. 151 (4), 778-793 (2012).
- Jackrel, M. E., et al. Potentiated Hsp104 Variants Antagonize Diverse Proteotoxic Misfolding Events. Cell. 156 (1-2), 170-182 (2014).
- Wittrup, K. D., Verdine, G. L., Wittrup, K. D., Verdine, G. L. . Methods in Enzymology. 503, 13-14 (2012).
- Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. R. . Methods in Enzymology. 154, 164-175 (1987).
- Miyazaki, K. Creating Random Mutagenesis Libraries by Megaprimer PCR of Whole Plasmid (MEGAWHOP). Directed Evolution Library Creation: Methods in Molecular Biology. eds FrancesH Arnold & George Georgiou. 231, 23-28 (2003).
- Saibil, H. Chaperone machines for protein folding, unfolding and disaggregation. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (10), 630-642 (2013).
- Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat. Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
- Armakola, M., Hart, M. P., Gitler, A. D. TDP-43 toxicity in yeast. Methods. 53 (3), 238-245 (2011).
- Alberti, S., Gitler, A. D., Lindquist, S. A suite of Gateway® cloning vectors for high-throughput genetic analysis in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 24 (10), 913-919 (2007).
