Isolere forsterkes Hsp104 Varianter Bruke gjær Proteinopathy modeller

Summary

Yeast proteinopathy models are valuable tools to assess the toxicity and aggregation of proteins implicated in disease. Here, we present methods for screening Hsp104 variant libraries for toxicity suppressors. This protocol could be adapted to screen any protein library for toxicity suppressors of any protein that is toxic in yeast.

Abstract

Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic lateral sclerosis, and α-synuclein, implicated in Parkinson’s disease, are toxic and form cytoplasmic aggregates in yeast. These features recapitulate protein pathologies observed in patients with these disorders. Thus, yeast are an ideal platform for isolating toxicity suppressors from libraries of protein variants. We are interested in applying protein disaggregases to eliminate misfolded toxic protein conformers. Specifically, we are engineering Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast that is uniquely capable of solubilizing both disordered aggregates and amyloid and returning the proteins to their native conformations. While Hsp104 is highly conserved in eukaryotes and eubacteria, it has no known metazoan homologue. Hsp104 has only limited ability to eliminate disordered aggregates and amyloid fibers implicated in human disease. Thus, we aim to engineer Hsp104 variants to reverse the protein misfolding implicated in neurodegenerative disorders. We have developed methods to screen large libraries of Hsp104 variants for suppression of proteotoxicity in yeast. As yeast are prone to spontaneous nonspecific suppression of toxicity, a two-step screening process has been developed to eliminate false positives. Using these methods, we have identified a series of potentiated Hsp104 variants that potently suppress the toxicity and aggregation of TDP-43, FUS, and α-synuclein. Here, we describe this optimized protocol, which could be adapted to screen libraries constructed using any protein backbone for suppression of toxicity of any protein that is toxic in yeast.

Introduction

Gjær proteinopathy modeller har blitt utviklet for protein misfolding lidelser inkludert amyotrofisk lateral sklerose (ALS) og Parkinsons sykdom (PD) ^1-3. Uttrykk av proteiner TDP-43 og FUS, som misfold ALS pasienter, er giftige og mislocalize å danne cytoplasmatiske aggregater i gjær ^1,2. Tilsvarende ekspresjon av α-synuclein (α-syn), som er implisert i PD, er giftig og mislocalizes til å danne aggregater i gjær cytoplasmatiske ^3. Disse funksjonene rekapitulere fenotyper hos pasienter med disse lidelsene ^4,5. Dermed gjær modellene gir en nyttig plattform for screening for proteiner eller små molekyler som hindrer eller reversere disse fenotyper ^2,6-13. Vi er interessert i utviklingen av proteiner som er i stand til å reversere aggregering og toksisitet på grunn av TDP-43, FUS, og α-syn. Vi fokuserer på Hsp104, en AAA + protein fra gjær som er unikt i stand til disaggregating proteiner både frOM amorfe aggregater og amyloid i gjær, men det har ingen menneskelig homologue ^14,15. Hsp104 er finjustert til disaggregert endogene gjær prioner og har bare begrenset evne til å disaggregert underlag innblandet i menneske nevrodegenerative sykdommer, som det aldri vanligvis møter ^16,17. Dermed har vi som mål å konstruere forbedrede versjoner av Hsp104 som er i stand til å efficaciously disaggregert disse menneskelige underlag. For å gjøre dette, vi konstruere store biblioteker av Hsp104 varianter bruker feilutsatt PCR; Disse bibliotekene kan screenes ved hjelp av gjær proteinopathy modellene ^17. Vi har vedtatt en domene målrettet tilnærming til å konstruere og screening biblioteker, som Hsp104 er veldig stort ^17. Vi innledningsvis fokusert på midten domene (MD) av Hsp104 ^17, selv om lignende metoder kan anvendes for å screene andre domener. Disse modellene muliggjør screening for aktivitet disaggregase direkte, i motsetning til alternative teknikker så som overflate skjerm, som er restenricted å bruke for å overvåke binding ^18.

Vår protokollen er basert på to screeningfremgangsmåten (figur 1). Først blir Hsp104 varianter som undertrykker giftigheten av sykdommen substrat i gjær valgt. For å gjøre dette, varianter av Hsp104 og sykdomsassosierte underlaget er kotransformert inn Δ hsp104 gjær. Vi ansetter Δ hsp104 gjær å utforske Hsp104 sekvens plass i fravær av villtype (WT) Hsp104 ^17. Viktigere, ikke sletting av Hsp104 ikke påvirke α-syn, FUS, eller TDP-43 toksisitet i gjær, og uttrykk for Hsp104 ^WT gir minimal redning ^1,13,17. Gjæren blir deretter sådd ut på induserende medier for å indusere ekspresjon av begge proteinene. Gjær husing Hsp104 varianter som undertrykker toksisitet av sykdomsassosierte substrat konferere vekst av kolonien. Disse variantene er valgt for videre analyse, mens kolonier opprettholde varianter som ikke undertrykker toksisitet dø. Imidlertidfalske positiver er et betydelig problem i dette skjermbildet. Uttrykk for TDP-43, FUS, og α-syn er svært giftige, noe som skaper et sterkt seleksjonspress for utseendet på spontane genetiske undertrykkere av toksisitet relatert til Hsp104 variant blir uttrykt. Således har vi benyttet en sekundær skjerm som også er relativt høy gjennomstrømning for å eliminere disse ikke-spesifikke toksisitet ¹⁷ suppressorer. I denne sekundære skjermen, velges gjær behandlet med 5-Fluorootic Acid (5-FOA) for å motvirke velger for Hsp104 plasmid ^19. Stammene blir så vurdert for substratet (TDP-43, FUS, eller α-syn) toksisitet via spotting assay for å sikre at giftigheten av substratet er gjenopprettet etter tap av den Hsp104 plasmidet. Således gjær hvori toksisitet er gjengitt i denne andre screening formodentlig opprinnelig viste undertrykkelse toksisitet på grunn av tilstedeværelsen av Hsp104 variant. Disse gjær er utpekt som "treff" og Hsp104 plasmid bør da væregjenvunnet og sekvensert for å identifisere de mutasjoner i genet Hsp104 ¹⁷ (figur 1). Eventuelle treff bør da bli bekreftet ved å konstruere mutasjonen uavhengig ved hjelp seterettet mutagenese og deretter retesting for toksisitet undertrykkelse. De potensielle bruksområder for denne protokollen er brede. Ved hjelp av disse metodene, kan biblioteker av en hvilken som helst type protein bli screenet for varianter som undertrykker toksisitet av en hvilken som helst substrat protein som er toksisk i gjær.

Protocol

1. Bibliotek Generation Å konstruere biblioteker av Hsp104 bruker domenespesifikke feilutsatt PCR, først forsterke domenet av interesse med en feil utsatt DNA polymerase 20. Rens det PCR-produktet ved gel-ekstraksjon. Utfør en megaprimer forlengelse trinn ved hjelp av en standard seterettet mutagenese protokoll: kombinere 50 ng mal plasmid, 250 ng megaprimer, 200 mikrometer dNTPs, og high-fidelity DNA polymerase i PCR buffer, og fortynn til 50 pl totalvolum med PCR grade vann…

Representative Results

Vi har konstruert et bibliotek av Hsp104 varianter randomiserte midt-domenet og screenet for undertrykkelse av det TDP-43 toksisitet. Biblioteket ble transformert, og sådd ut på plater glukose og galaktose (figur 2) for å vurdere stringensen av skjermen. Enkle kolonier ble utvalgt og stammene ble valgt ved hjelp av telleren 5-FOA å eliminere Hsp104 plasmidet. Disse stammene ble så vurdert for å bekrefte at toksisitet skyldtes TDP-43 alene, uten Hsp104 varianter. Spotting analyser av en delmengde a…

Discussion

Her presenterer vi vår tilnærming til å isolere potensierte Hsp104 varianter som undertrykker giftigheten av sykdomsassosierte substrater som bruker gjær proteinopathy modeller. Ved å bruke denne tilnærmingen, kan store biblioteker av alternative tilbud bli vist i høy gjennomstrømning, med den eneste begrensningen er antall varianter som passerer 5-FOA sekundær skjerm. Ved å utføre disse trinnene i 96 brønns, vi rutinemessig skjermen opptil 200 treff om gangen i den fem-FOA steg i løpet av 1-2 uker. Antall …

Materials

Table of Specific Materials/Equipment
Name	Company	Catalog Number	Comments
GeneMorphII EZClone Domain Mutagenesis Kit	Agilent	200552
150mm Petri dishes	Falcon	351058
5-Fluorootic Acid	Research Products International	f10501-5.0
96-DeepWell 2mL Plates	Eppendorf	0030 502.302
96 bold replicator tool	V&P Scientific	vp-404
ExoSAP-IT	Affymetrix	78200