Proteomik von Makrophagen durch 2D-Elektrophorese

Summary

Makrophagen sind die Schlüsselzellen, die an der Pathogenität des Wirts beteiligt sind. Makrophagen weisen eine phänotypische und funktionelle Diversität auf, die durch Proteomanalyse analysiert und nachgewiesen werden kann. In diesem Artikel wird beschrieben, wie eine 2D-Elektrophorese von Primärkulturen menschlicher Makrophagen durchgeführt wird, die in den M1- oder M2-Phänotyp differenziert sind.

Abstract

Das Ziel des hier beschriebenen zweidimensionalen (2D) Elektrophoreseprotokolls ist es, zu zeigen, wie der Phänotyp von menschlichen kultivierten Makrophagen analysiert werden kann. Die Schlüsselrolle von Makrophagen wurde bei verschiedenen pathologischen Erkrankungen wie entzündlichen, immunologischen und infektiösen Krankheiten gezeigt. In diesem Protokoll verwenden wir Primärkulturen von humanen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen, die in den Phänotyp M1 (pro-inflammatorisch) oder M2 (entzündungshemmend) unterschieden werden können. Dieses in vitro Modell ist zuverlässig für die Untersuchung der biologischen Aktivitäten von M1- und M2-Makrophagen und auch für einen proteomischen Ansatz. Proteomische Techniken sind nützlich, um den Phänotyp und das Verhalten von M1- und M2-Makrophagen während der Pathogenität des Wirts zu vergleichen. Die 2D-Gelelektrophorese ist eine leistungsstarke Proteomtechnik zur gleichzeitigen Kartierung einer großen Anzahl von Proteinen oder Polypeptiden. Wir beschreiben das Protokoll der 2D-Elektrophorese mit Fluoreszenzfarbstoffen, das als 2D-Differential-Gelelektrophorese (DIGE) bezeichnet wird. Die M1- und M2-Makrophagenproteine werden vor der Trennung durch isoelektrische Fokussierung entsprechend ihrem isoelektrischen Punkt in der ersten Dimension und ihrer Molekülmasse in der zweiten Dimension mit Cyaninfarbstoffen markiert. Getrennte Protein- oder Polypeptid-Spots werden dann verwendet, um Unterschiede in der Protein- oder Polypeptid-Expression zu erkennen. Die hier beschriebenen proteomischen Ansätze ermöglichen die Untersuchung der Makrophagenproteinveränderungen, die mit verschiedenen Erkrankungen wie Wirtspathogenität oder mikrobiellen Toxinen verbunden sind.

Introduction

Makrophagen sind heterogen und Kunststoff-Zellen, die in der Lage, verschiedene funktionelle Phänotypen zu erwerben sind. In vivo werden diese Zellen auf eine Vielzahl von Mikroumwelt signalssuch mikrobielle Produkte, Cytokine, etc. ¹ In vitro. Die pro-inflammatorischen Phänotyps (M1) von Makrophagen durch Lipopolysaccharid (LPS) und dem anti-inflammatorischen Phänotyps (M2) durch einige Cytokine, wie Interleukin-4 (IL-4) induziert werden. Darüber hinaus können Makrophagen aus einem aktivierten M1 bis M2 Phänotyp zu wechseln, und umgekehrt, auf spezifische Signale ^2.

Abhängig von der Phänot....

Protocol

Das Protokoll folgt den Richtlinien unserer Institutionen menschlichen Forschungsethikkommission. Buffy-Coat von gesunden menschlichen Spendern wurden aus dem regionalen Blutspendezentrum (Lille, Frankreich) erhalten. Proben aus den Buffy Coats erhalten werden als Inserm Sammlung (n ° DC2010-1209) erklärt.

1. Material und Kultur Medienvorbereitung

1. Verdünnen 10x Phosphatpuffer Saline (PBS) in sterilem destilliertem Wasser, um 1x PBS erhalten.
2. Machen RPMI 1640 Medium mit Gentamicin (40 ug / ml) und L-Glutamin (2 mM), mit und ohne 10% gepooltem Humanserum.

2. Primärkulturen von Monozyten ....

Results

Um entsprechende Differenz Proteomanalyse durchzuführen, sollte die Verarbeitung von zu analysierenden Proben überprüft werden.

Im dargestellten Beispiel ist die Zellkulturqualität von Makrophagen für die morphologische und molekulare Aspekte erforderlich, wie zuvor veröffentlicht ^5. Die Differenzierung von Monozyten in Makrophagen und die Homogenität der Kultur wurde durch Phasenmikroskopie verfolgt. Figur 1 zeigt ein Beispiel von primären Kulturen von M1 und M2 .......

Discussion

Das hier beschriebene Protokoll Details eines Verfahrens, um die Auswirkungen verschiedener Stimuli der beiden Subtypen von Makrophagen, M1 (proinflammatorischen) und M2 (anti-inflammatorische) analysieren. Primärkulturen von M1 und M2 Makrophagen wurden aus der Differenzierung der Monozyten, erhalten wie zuvor veröffentlichten ^7.

Das Verfahren von 2D DIGE Gelelektrophorese erfordert spezielle Materialien und Ausrüstung, wie IEF-Zelle für Isoelektrofokussierung, low-Fluoreszenzpla.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640	Invitrogen	31870-074
PBX 10 X	Invitrogen	14200-083
L-Glutamin-200 mM-100X	Invitrogen	25030-024
Gentamycin 10 mg/ml	Invitrogen	15710-049
Humanserum	Invitrogen	34005100
Ficoll d = 1.077	ATGC	L6115
Leucosep	Dutscher	16760
6-Well-Platte PRIMARIA	Becton Dickinson	353846
IL-4	Promocell	B-61410
Lipopolysaccharid	Sigma-Aldrich	L-2654
Giemsa	Fluka	48900
EDTA MM372,2	Forschung Organische Stoffe	3.00E+01
Filter 0.22 &Mikro; m	Millipore	SCGPTORE
100 ml Zylinder	Corning	430182
TCEP	Interchim	UP242214
Bradford-Reagenz	Bio-Rad	5000006
Cy3+Cy5-Reaktivfarbstoff	GE Healthcare	25-8009-83
IPG-Streifen 3-10 24cm	GE Healthcare	17-6002-44
Protean IEF-Zelle	Bio-Rad	165-4000
Niedrigschmelzende Agarose	Invitrogen	15517-014
Ettan-Daltsix System	GE Healthcare	80-6485-08
Ettan DIGE Imager scanner	GE Healthcare
Progenesis Samespot	Nichtlineare Dynamik
50 ml Röhrchen	beliebig	n/a
15 ml Tuben	beliebiger Lieferant	n/a
CHAPS	Sigma-Aldrich	C5070
Uré e	Merk	108484-500
Thiouré e	Sigma-Aldrich	T7875
DTT	Bio-Rad	1610611
APS	Sigma-Aldrich	A3678
TEMED	Sigma-Aldrich	T9281
Tris Base	Sigma-Aldrich	T1503
Tris HCl	Sigma-Aldrich	T3253
Pharmalytes 3-10	GE Healthcare	17-0456-01
SDS	Sigma-Aldrich	L3773
Bromphenolblau	Sigma-Aldrich	114391
Glycerin	Sigma-Aldrich	G6279
Acrylamid 40%	Bio-Rad	161-0148
2D-Reinigung	GE Healthcare	80-6454-51
Glycin	Sigma-Aldrich	G7126
Dimé Thylformamid	Sigma-Aldrich	22705-6
Elektrodendochte	Bio-Rad	165-4071