Proteomik von Makrophagen durch 2D-Elektrophorese
Summary
Macrophages are the key cells involved in host pathogenicity. Macrophages display phenotypic and functional diversity that can be analysed and detected by proteomic analysis. This article describes how to perform 2D electrophoresis of primary cultures of human macrophages differentiated into M1 or M2 phenotype.
Abstract
The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The key role of macrophages has been shown in various pathological disorders such as inflammatory, immunological, and infectious diseases. In this protocol, we use primary cultures of human monocyte-derived macrophages that can be differentiated into the M1 (pro-inflammatory) or the M2 (anti-inflammatory) phenotype. This in vitro model is reliable for studying the biological activities of M1 and M2 macrophages and also for a proteomic approach. Proteomic techniques are useful for comparing the phenotype and behaviour of M1 and M2 macrophages during host pathogenicity. 2D gel electrophoresis is a powerful proteomic technique for mapping large numbers of proteins or polypeptides simultaneously. We describe the protocol of 2D electrophoresis using fluorescent dyes, named 2D Differential Gel Electrophoresis (DIGE). The M1 and M2 macrophages proteins are labelled with cyanine dyes before separation by isoelectric focusing, according to their isoelectric point in the first dimension, and their molecular mass, in the second dimension. Separated protein or polypeptidic spots are then used to detect differences in protein or polypeptide expression levels. The proteomic approaches described here allows the investigation of the macrophage protein changes associated with various disorders like host pathogenicity or microbial toxins.
Introduction
Makrophagen sind heterogen und Kunststoff-Zellen, die in der Lage, verschiedene funktionelle Phänotypen zu erwerben sind. In vivo werden diese Zellen auf eine Vielzahl von Mikroumwelt signalssuch mikrobielle Produkte, Cytokine, etc. 1 In vitro. Die pro-inflammatorischen Phänotyps (M1) von Makrophagen durch Lipopolysaccharid (LPS) und dem anti-inflammatorischen Phänotyps (M2) durch einige Cytokine, wie Interleukin-4 (IL-4) induziert werden. Darüber hinaus können Makrophagen aus einem aktivierten M1 bis M2 Phänotyp zu wechseln, und umgekehrt, auf spezifische Signale 2.
Abhängig von der Phänotyp wird Makrophagen verschiedene Funktionen haben. M1 Makrophagen sind Zellen, die pro-inflammatorische Zytokine wie Tumornekrosefaktor α (TNF-α) zu erzeugen, um Mikroorganismen oder Tumorzellen 3 töten. Im Gegensatz dazu M2 Makrophagen verhindern, dass diese Entzündungsreaktion wie bei der Wundheilung und Fibrose durch die Herstellung anti inflammatory Faktoren wie TGF-β 3,4.
Menschliche periphere mononukleäre Blutzellen von gesunden Spendern wurden durch Ficoll-Dichtegradienten-Zentrifugation, wie zuvor beschrieben 5 wird eine von Boyum 6 angepaßt isoliert. Makrophagen in Kultur kann nach 6 Tagen Primärkultur 7 in M1 oder M2-Phänotyp unterschieden werden.
Analyse der Proteinexpression oder Proteinveränderungen zwischen den beiden Subtypen von Makrophagen unter verschiedenen gesteuerten Reize, wie Host Pathogenität oder mikrobielle Toxine, hilfreich sein, um die Funktionalität der pro- und anti-inflammatorischen Makrophagen zu entschlüsseln.
Proteomics sind einzigartige Werkzeuge zur direkten Überwachung von Proteinen, die spezifisch nach oben oder in der menschlichen kultivierten Makrophagen unter verschiedenen Stimuli herunterreguliert sind. Fluoreszierende Farbstoffe haben einige der Einschränkungen der 2D-Gelelektrophorese, wie niedrige Empfindlichkeit und Bildanalyse 8 gelöst < / Sup>. Die Farbstoffe reagieren mit Cystein-Reste haben die Nachweisempfindlichkeit im Vergleich zu denen der Reaktion mit Lysinresten 9 erhöht. In einer früheren Studie haben wir gezeigt, die Nützlichkeit DIGE Sättigungs Markierung für die Analyse von Proben knapp 10 gegenüber dem klassischen silbergefärbten 2D-Elektrophorese 11. Diese Technologie ist hilfreich bei der schnellen Analyse von Proteinmodifikationen zwischen den zwei Subtypen von Makrophagen oder zwischen unbehandelten und behandelten Makrophagen aus dem gleichen Subtyp.
Die Vorteile dieser Technik sind Proteomik, die Zugang zu den Informationen der Proteingröße und post-translationalen Modifikationen durch Analyse der 2D-Gel-12. Es sollte berücksichtigt werden, dass dies nicht ein hoher Durchsatz-Technik entnommen werden, wodurch die Anzahl der Proben, die analysiert werden können. Die Entwicklung von Hochdurchsatz-Assays, die auf Massenspektrometrie als prüft kürzlich 13 kann dies zu verbessern.
_content "> Hier präsentieren wir, wie man 2D DIGE Analyse aus der Proteinextraktion von kultivierten Makrophagen durch die Prozesse der Elektrophorese Isoelektrofokussierung durchzuführen, und SDS-PAGE sowie Informationen über den Nutzen einer angemessenen 2D-Software.Protocol
Representative Results
Discussion
Das hier beschriebene Protokoll Details eines Verfahrens, um die Auswirkungen verschiedener Stimuli der beiden Subtypen von Makrophagen, M1 (proinflammatorischen) und M2 (anti-inflammatorische) analysieren. Primärkulturen von M1 und M2 Makrophagen wurden aus der Differenzierung der Monozyten, erhalten wie zuvor veröffentlichten 7.
Das Verfahren von 2D DIGE Gelelektrophorese erfordert spezielle Materialien und Ausrüstung, wie IEF-Zelle für Isoelektrofokussierung, low-Fluoreszen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by Inserm. Marion Bouvet is a fellow of the French Ministry for Research and Technology. Annie Turkieh is a fellow granted by European Union FP7 HOMAGE (305507).
Materials
| Name | Company | Catalog number |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 31870-074 |
| PBX 10 X | Invitrogen | 14200-083 |
| L-glutamine-200mM-100X | Invitrogen | 25030-024 |
| gentamycin 10 mg/mL | Invitrogen | 15710-049 |
| human serum | Invitrogen | 34005100 |
| Ficoll d=1,077 | ATGC | L6115 |
| Leucosep | Dutscher | 16760 |
| 6-wells plate PRIMARIA | Becton Dickinson | 353846 |
| IL-4 | Promocell | B-61410 |
| lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | L-2654 |
| Giemsa | Fluka | 48900 |
| EDTA MM372,2 | Research Organics | 3.00E+01 |
| Filter 0,22µm | Millipore | SCGPTORE |
| 100 mL cylinder | Corning | 430182 |
| TCEP | Interchim | UP242214 |
| Bradford reagent | Bio-Rad | 5000006 |
| Cy3+Cy5-reactive dye | GE Healthcare | 25-8009-83 |
| IPG strip 3-10 24cm | GE Healthcare | 17-6002-44 |
| Protean IEF cell | Bio-Rad | 165-4000 |
| Low-melting agarose | Invitrogen | 15517-014 |
| Ettan-Daltsix system | GE Healthcare | 80-6485-08 |
| Ettan DIGE Imager scanner | GE Healthcare | |
| Progenesis Samespot | Non linear dynamics | |
| 50 ml tubes | any supplier | n/a |
| 15 ml tubes | any supplier | n/a |
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C5070 |
| Urée | Merk | 108484-500 |
| Thiourée | Sigma-Aldrich | T7875 |
| DTT | Bio-Rad | 1610611 |
| APS | Sigma-Aldrich | A3678 |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | T3253 |
| Pharmalytes 3-10 | GE Healthcare | 17-0456-01 |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3773 |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G6279 |
| Acrylamide 40% | Bio-Rad | 161-0148 |
| 2D clean Up | GE Healthcare | 80-6454-51 |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 |
| Diméthylformamide | Sigma-Aldrich | 22705-6 |
| electrode wicks | Bio-Rad | 165-4071 |
References
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