Proteomic פרופיל של המקרופאגים על ידי 2D אלקטרופורזה
Summary
Macrophages are the key cells involved in host pathogenicity. Macrophages display phenotypic and functional diversity that can be analysed and detected by proteomic analysis. This article describes how to perform 2D electrophoresis of primary cultures of human macrophages differentiated into M1 or M2 phenotype.
Abstract
The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The key role of macrophages has been shown in various pathological disorders such as inflammatory, immunological, and infectious diseases. In this protocol, we use primary cultures of human monocyte-derived macrophages that can be differentiated into the M1 (pro-inflammatory) or the M2 (anti-inflammatory) phenotype. This in vitro model is reliable for studying the biological activities of M1 and M2 macrophages and also for a proteomic approach. Proteomic techniques are useful for comparing the phenotype and behaviour of M1 and M2 macrophages during host pathogenicity. 2D gel electrophoresis is a powerful proteomic technique for mapping large numbers of proteins or polypeptides simultaneously. We describe the protocol of 2D electrophoresis using fluorescent dyes, named 2D Differential Gel Electrophoresis (DIGE). The M1 and M2 macrophages proteins are labelled with cyanine dyes before separation by isoelectric focusing, according to their isoelectric point in the first dimension, and their molecular mass, in the second dimension. Separated protein or polypeptidic spots are then used to detect differences in protein or polypeptide expression levels. The proteomic approaches described here allows the investigation of the macrophage protein changes associated with various disorders like host pathogenicity or microbial toxins.
Introduction
המקרופאגים הם תאים הטרוגנית ופלסטיק כי הם מסוגלים לרכוש פנוטיפים פונקציונליים שונים. בחי, תאים אלה מגיבים למגוון רחב של signalssuch הסביבתי מיקרו מוצרים של חיידקים, ציטוקינים, וכו '. 1. במבחנה, פנוטיפ פרו-הדלקתי (M1) של מקרופאג יכול להיגרם על ידי lipopolysaccharide (LPS) ואת הפנוטיפ אנטי דלקתי (M2) על ידי כמה ציטוקינים כגון אינטרלוקין 4 (IL-4). יתר על כן, מקרופאגים יכולים לעבור מM1 הופעל לפנוטיפ M2, ולחלופין, על אותות ספציפיים 2.
בהתאם לפנוטיפ, יהיו לי מקרופאגים פונקציות שונות. מקרופאגים M1 הם תאים המייצרים ציטוקינים פרו-דלקתיים, כגון α גורם נמק גידול (TNF-α), להרוג מיקרואורגניזמים או תאי גידול 3. בניגוד לכך, מקרופאגים M2 למנוע תגובה הדלקתית אלה כמו בריפוי פצעים וסיסטיק על ידי ייצור אנטי-inflammatorגורמי y כגון TGF-β 3,4.
תאי הדם היקפיים mononuclear אדם מתורמים בריאים בודדו על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות Ficoll כפי שתואר לעיל 5 תוך שימוש בטכניקה שהותאמה מBoyum 6. המקרופאגים בתרבות יכולים להיות מובחנים לפנוטיפ M1 או M2 לאחר 6 ימים של התרבות העיקרית 7.
ניתוח של ביטוי חלבון או חלבון שינויים בין שני תת הסוגים של מקרופאגים תחת גירויים מבוקרים שונים, כגון פתוגניות מארח או רעלנים של חיידקים, יהיה מועיל כדי לפענח את הפונקציונליות של פרו ומקרופאגים אנטי דלקתיים.
פרוטאומיקה הן כלים ייחודיים לניטור ישיר של חלבונים כי הם במיוחד למעלה או למטה מוסדרים במקרופאגים התרבותיים האנושיים תחת גירויים שונים. צבעי ניאון פתרו חלק מהמגבלות של ג'ל אלקטרופורזה 2D, כמו רגישות נמוכה וניתוח תמונה 8 < / Sup>. הצבעים מגיבים עם שאריות ציסטאין הגדילו את רגישות זיהוי בהשוואה לאלו מגיבים עם שאריות ליזין 9. במחקר קודם, שהראינו את התועלת של תיוג רוויה DIGE לניתוח דגימות נדירות 10 בהשוואה לאלקטרופורזה מוכתמת הכסף הקלאסי 2D 11. טכנולוגיה זו שימושית במהירות ניתוח שינויי חלבון בין שני תת הסוגים של מקרופאגים או בין מקרופאגים שלא טופלו ומטופל מאותו תת-הסוג.
היתרונות של טכניקת proteomic זה שיש גישה למידע של גודל חלבון ולאחר translational שינויים על ידי ניתוח ג'ל 2D 12. יש לקחת בחשבון שזה לא טכניקת תפוקה גבוהה, המגביל את מספר הדגימות שניתן לנתח. הפיתוח של מבחני תפוקה גבוהים המבוססים על ספקטרומטר מסה כפי שנסקר לאחרונה 13 יכולים לשפר את זה.
_content "> כאן אנו מציגים כיצד לבצע ניתוח 2D DIGE ממיצוי החלבון של מקרופאגים התרבותיים באמצעות התהליכים של אלקטרופורזה, isoelectrofocusing, וSDS-PAGE וכן מידע על השימושיות של תוכנת 2D נאותה.Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המתואר במסמך זה מפרט שיטות כדי לנתח את ההשפעה של גירויים שונים משני תת הסוגים של מקרופאגים, M1 (פרו-דלקתי) ו- M2 (אנטי דלקתי). תרבויות עיקריות של מקרופאגים M1 ו- M2 התקבלו מההתמיינות של מונוציטים כפי שפורסמו בעבר 7.
ההליך …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by Inserm. Marion Bouvet is a fellow of the French Ministry for Research and Technology. Annie Turkieh is a fellow granted by European Union FP7 HOMAGE (305507).
Materials
| Name | Company | Catalog number |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 31870-074 |
| PBX 10 X | Invitrogen | 14200-083 |
| L-glutamine-200mM-100X | Invitrogen | 25030-024 |
| gentamycin 10 mg/mL | Invitrogen | 15710-049 |
| human serum | Invitrogen | 34005100 |
| Ficoll d=1,077 | ATGC | L6115 |
| Leucosep | Dutscher | 16760 |
| 6-wells plate PRIMARIA | Becton Dickinson | 353846 |
| IL-4 | Promocell | B-61410 |
| lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | L-2654 |
| Giemsa | Fluka | 48900 |
| EDTA MM372,2 | Research Organics | 3.00E+01 |
| Filter 0,22µm | Millipore | SCGPTORE |
| 100 mL cylinder | Corning | 430182 |
| TCEP | Interchim | UP242214 |
| Bradford reagent | Bio-Rad | 5000006 |
| Cy3+Cy5-reactive dye | GE Healthcare | 25-8009-83 |
| IPG strip 3-10 24cm | GE Healthcare | 17-6002-44 |
| Protean IEF cell | Bio-Rad | 165-4000 |
| Low-melting agarose | Invitrogen | 15517-014 |
| Ettan-Daltsix system | GE Healthcare | 80-6485-08 |
| Ettan DIGE Imager scanner | GE Healthcare | |
| Progenesis Samespot | Non linear dynamics | |
| 50 ml tubes | any supplier | n/a |
| 15 ml tubes | any supplier | n/a |
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C5070 |
| Urée | Merk | 108484-500 |
| Thiourée | Sigma-Aldrich | T7875 |
| DTT | Bio-Rad | 1610611 |
| APS | Sigma-Aldrich | A3678 |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | T3253 |
| Pharmalytes 3-10 | GE Healthcare | 17-0456-01 |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3773 |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G6279 |
| Acrylamide 40% | Bio-Rad | 161-0148 |
| 2D clean Up | GE Healthcare | 80-6454-51 |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 |
| Diméthylformamide | Sigma-Aldrich | 22705-6 |
| electrode wicks | Bio-Rad | 165-4071 |
References
- van Ginderachter, J. A., et al. Classical and alternative activation of mononuclear phagocytes: picking the best of both worlds for tumor promotion. Immunobiology. 211, (2006).
- Porcheray, F., et al. Macrophage activation switching: an asset for the resolution of inflammation. Clin. Exp. Immunol. 142, 481-489 (2005).
- Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).
- Mantovani, A., Locati, M., Vecchi, A., Sozzani, S., Allavena, P. Decoy receptors: a strategy to regulate inflammatory cytokines and chemokines. Trends Immunol. 22, 328-336 (2001).
- Pinet, F., et al. Morphology, homogeneity and functionality of human monocytes-derived macrophages. Cell. Mol. Biol. 49, 899-905 (2003).
- Boyum, A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1. 97, 77-89 (1968).
- Chinetti-Gbaguidi, G., et al. Human atherosclerotic plaque alternative macrophages display low cholesterol handling but high phagocytosis because of distinct activities of the PPARγ and LXRα pathways. Circ. Res. 108, 985-995 (2011).
- Tonge, R., et al. Validation and development of fluorescence two-dimensional differential gel electrophoresis proteomics technology. Proteomics. 1, 377-396 (2001).
- Shaw, J., et al. Evaluation of saturation labelling two-dimensional difference gel electrophoresis fluorescent dyes. Proteomics. 3, 1181-1195 (2003).
- Dupont, A., et al. Application of saturation dye 2D DIGE proteomics to characterize proteins modulated by oxidized low density lipoprotein treatment of human macrophages. J. Proteome Res. 7, 3572-3582 (2008).
- Dupont, A., et al. Two-dimensional maps and databases of the human macrophage proteome and secretome. Proteomics. 4, 1761-1778 (2004).
- Acosta-Martin, A. E., et al. Impact of incomplete DNase I treatment on human macrophage analysis. Proteomics Clin. Appl. 3, 1236-1246 (2009).
- Acosta-Martin, A. E., Lane, L. Combining bioinformatics and MS-based proteomics: clinical implications. Expert Rev Proteomics. , (2014).
- Boytard, L., et al. Role of proinflammatory CD68+MR- macrophages in peroxiredoxin-1 expression and in abdominal aortic aneurysms in humans. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 33, 431-438 (2013).
