Протеомный профилирования макрофагов 2D электрофореза
Summary
Macrophages are the key cells involved in host pathogenicity. Macrophages display phenotypic and functional diversity that can be analysed and detected by proteomic analysis. This article describes how to perform 2D electrophoresis of primary cultures of human macrophages differentiated into M1 or M2 phenotype.
Abstract
The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The key role of macrophages has been shown in various pathological disorders such as inflammatory, immunological, and infectious diseases. In this protocol, we use primary cultures of human monocyte-derived macrophages that can be differentiated into the M1 (pro-inflammatory) or the M2 (anti-inflammatory) phenotype. This in vitro model is reliable for studying the biological activities of M1 and M2 macrophages and also for a proteomic approach. Proteomic techniques are useful for comparing the phenotype and behaviour of M1 and M2 macrophages during host pathogenicity. 2D gel electrophoresis is a powerful proteomic technique for mapping large numbers of proteins or polypeptides simultaneously. We describe the protocol of 2D electrophoresis using fluorescent dyes, named 2D Differential Gel Electrophoresis (DIGE). The M1 and M2 macrophages proteins are labelled with cyanine dyes before separation by isoelectric focusing, according to their isoelectric point in the first dimension, and their molecular mass, in the second dimension. Separated protein or polypeptidic spots are then used to detect differences in protein or polypeptide expression levels. The proteomic approaches described here allows the investigation of the macrophage protein changes associated with various disorders like host pathogenicity or microbial toxins.
Introduction
Макрофаги являются гетерогенными и пластмассовые клетки, которые способны приобретать различные функциональные фенотипы. В естественных условиях, эти клетки отвечают на большое разнообразие микро окружающей signalssuch как микробных продуктов, цитокины, и т.д.. 1. В пробирке, про-воспалительных фенотип (М1) из макрофагов может быть индуцирована липополисахарида (LPS) и противовоспалительного фенотипа (M2) с помощью некоторых цитокинов, таких как интерлейкин-4 (IL-4). Кроме того, макрофаги могут переключаться с активированным M1 M2 к фенотипу, и, наоборот, при определенных сигналов 2.
В зависимости от фенотипа, макрофаги будут иметь различные функции. M1 макрофаги являются клетки, которые продуцируют провоспалительные цитокины, такие как фактор некроза опухоли α (TNF-α), чтобы убить микроорганизмы или опухолевые клетки 3. В отличие от этого, М2 макрофаги предотвратить эти воспалительную реакцию, как в заживлении ран и фиброза производя анти-inflammatorY факторы, такие как TGF-β 3,4.
Человеческие мононуклеарные клетки периферической крови от здоровых доноров были выделены с помощью Ficoll центрифугированием в градиенте плотности, как описано выше 5 с помощью метода, приспособленный от 6 Boyum. Макрофаги в культуре могут быть дифференцированы в фенотипе М1 или М2 через 6 дней после первичной культуры 7.
Анализ экспрессии белка или белка изменений между двумя подтипами макрофагов при различных величинах стимулами, такими как принимающей патогенности или микробные токсины, будет полезно, чтобы расшифровать функциональные возможности про- и противовоспалительных макрофагов.
Протеомика уникальные инструменты для прямого мониторинга белков, которые специфически вверх или вниз регулируется в культивируемых макрофагов человека при различных раздражителей. Флуоресцентные красители были решены некоторые из ограничений электрофореза гель 2D, таких как низкой чувствительности и анализа изображений 8 < / SUP>. Красители, реагирующие с остатками цистеина увеличили чувствительность обнаружения по сравнению с теми в реакцию с остатками лизина 9. В предыдущем исследовании, мы доказали полезность ПГЛП маркировки насыщения для анализа скудных образцов 10 по сравнению с классической серебряной окрашенных 2D электрофореза 11. Эта технология является полезным в быстро анализа белковых модификаций между двумя подтипами макрофагов или между необработанных и обработанных макрофагов из того же подтипа.
Преимущества этого протеомного техники будут иметь доступ к информации о размерах белка и пост-трансляционных модификаций, анализируя 2D гель 12. Следует принимать во внимание, что это не техника с высокой пропускной способностью, ограничение количества образцов, которые могут быть проанализированы. Развитие высоких анализов пропускной основе масс-спектрометрии, рассмотренный недавно 13 может улучшить это.
_content "> Здесь мы представляем, как выполнить 2D Dige анализ от извлечения белка из культивируемых макрофагов через процессы электрофореза, Изоэлектрофокусирование, и SDS-PAGE, а также информация о полезности адекватной 2D программного обеспечения.Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол описано здесь подробно метод для анализа влияния различных раздражителей двух подтипов макрофагов, М1 (провоспалительного) и М2 (противовоспалительное). Первичные культуры из М1 и М2 макрофагов были получены от дифференциации моноцитов, опубликованной ранее 7.
<p class="jove_c…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by Inserm. Marion Bouvet is a fellow of the French Ministry for Research and Technology. Annie Turkieh is a fellow granted by European Union FP7 HOMAGE (305507).
Materials
| Name | Company | Catalog number |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 31870-074 |
| PBX 10 X | Invitrogen | 14200-083 |
| L-glutamine-200mM-100X | Invitrogen | 25030-024 |
| gentamycin 10 mg/mL | Invitrogen | 15710-049 |
| human serum | Invitrogen | 34005100 |
| Ficoll d=1,077 | ATGC | L6115 |
| Leucosep | Dutscher | 16760 |
| 6-wells plate PRIMARIA | Becton Dickinson | 353846 |
| IL-4 | Promocell | B-61410 |
| lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | L-2654 |
| Giemsa | Fluka | 48900 |
| EDTA MM372,2 | Research Organics | 3.00E+01 |
| Filter 0,22µm | Millipore | SCGPTORE |
| 100 mL cylinder | Corning | 430182 |
| TCEP | Interchim | UP242214 |
| Bradford reagent | Bio-Rad | 5000006 |
| Cy3+Cy5-reactive dye | GE Healthcare | 25-8009-83 |
| IPG strip 3-10 24cm | GE Healthcare | 17-6002-44 |
| Protean IEF cell | Bio-Rad | 165-4000 |
| Low-melting agarose | Invitrogen | 15517-014 |
| Ettan-Daltsix system | GE Healthcare | 80-6485-08 |
| Ettan DIGE Imager scanner | GE Healthcare | |
| Progenesis Samespot | Non linear dynamics | |
| 50 ml tubes | any supplier | n/a |
| 15 ml tubes | any supplier | n/a |
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C5070 |
| Urée | Merk | 108484-500 |
| Thiourée | Sigma-Aldrich | T7875 |
| DTT | Bio-Rad | 1610611 |
| APS | Sigma-Aldrich | A3678 |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | T3253 |
| Pharmalytes 3-10 | GE Healthcare | 17-0456-01 |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3773 |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G6279 |
| Acrylamide 40% | Bio-Rad | 161-0148 |
| 2D clean Up | GE Healthcare | 80-6454-51 |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 |
| Diméthylformamide | Sigma-Aldrich | 22705-6 |
| electrode wicks | Bio-Rad | 165-4071 |
References
- van Ginderachter, J. A., et al. Classical and alternative activation of mononuclear phagocytes: picking the best of both worlds for tumor promotion. Immunobiology. 211, (2006).
- Porcheray, F., et al. Macrophage activation switching: an asset for the resolution of inflammation. Clin. Exp. Immunol. 142, 481-489 (2005).
- Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).
- Mantovani, A., Locati, M., Vecchi, A., Sozzani, S., Allavena, P. Decoy receptors: a strategy to regulate inflammatory cytokines and chemokines. Trends Immunol. 22, 328-336 (2001).
- Pinet, F., et al. Morphology, homogeneity and functionality of human monocytes-derived macrophages. Cell. Mol. Biol. 49, 899-905 (2003).
- Boyum, A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1. 97, 77-89 (1968).
- Chinetti-Gbaguidi, G., et al. Human atherosclerotic plaque alternative macrophages display low cholesterol handling but high phagocytosis because of distinct activities of the PPARγ and LXRα pathways. Circ. Res. 108, 985-995 (2011).
- Tonge, R., et al. Validation and development of fluorescence two-dimensional differential gel electrophoresis proteomics technology. Proteomics. 1, 377-396 (2001).
- Shaw, J., et al. Evaluation of saturation labelling two-dimensional difference gel electrophoresis fluorescent dyes. Proteomics. 3, 1181-1195 (2003).
- Dupont, A., et al. Application of saturation dye 2D DIGE proteomics to characterize proteins modulated by oxidized low density lipoprotein treatment of human macrophages. J. Proteome Res. 7, 3572-3582 (2008).
- Dupont, A., et al. Two-dimensional maps and databases of the human macrophage proteome and secretome. Proteomics. 4, 1761-1778 (2004).
- Acosta-Martin, A. E., et al. Impact of incomplete DNase I treatment on human macrophage analysis. Proteomics Clin. Appl. 3, 1236-1246 (2009).
- Acosta-Martin, A. E., Lane, L. Combining bioinformatics and MS-based proteomics: clinical implications. Expert Rev Proteomics. , (2014).
- Boytard, L., et al. Role of proinflammatory CD68+MR- macrophages in peroxiredoxin-1 expression and in abdominal aortic aneurysms in humans. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 33, 431-438 (2013).
