2D電気泳動によるマクロファージのプロテオームプロファイリング
Summary
Macrophages are the key cells involved in host pathogenicity. Macrophages display phenotypic and functional diversity that can be analysed and detected by proteomic analysis. This article describes how to perform 2D electrophoresis of primary cultures of human macrophages differentiated into M1 or M2 phenotype.
Abstract
The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The key role of macrophages has been shown in various pathological disorders such as inflammatory, immunological, and infectious diseases. In this protocol, we use primary cultures of human monocyte-derived macrophages that can be differentiated into the M1 (pro-inflammatory) or the M2 (anti-inflammatory) phenotype. This in vitro model is reliable for studying the biological activities of M1 and M2 macrophages and also for a proteomic approach. Proteomic techniques are useful for comparing the phenotype and behaviour of M1 and M2 macrophages during host pathogenicity. 2D gel electrophoresis is a powerful proteomic technique for mapping large numbers of proteins or polypeptides simultaneously. We describe the protocol of 2D electrophoresis using fluorescent dyes, named 2D Differential Gel Electrophoresis (DIGE). The M1 and M2 macrophages proteins are labelled with cyanine dyes before separation by isoelectric focusing, according to their isoelectric point in the first dimension, and their molecular mass, in the second dimension. Separated protein or polypeptidic spots are then used to detect differences in protein or polypeptide expression levels. The proteomic approaches described here allows the investigation of the macrophage protein changes associated with various disorders like host pathogenicity or microbial toxins.
Introduction
マクロファージは、異なる機能の表現型を獲得することができる異種の、プラスチック細胞である。 インビボでの、これらの細胞は、微生物産物、サイトカインなど 1とマイクロ環境signalssuch多種多様に応答する。 インビトロ 、炎症誘発性表現型（M1）マクロファージのリポ多糖（LPS）およびインターロイキン4（IL-4）などのいくつかのサイトカインによる抗炎症性表現型（M2）によって誘導することができる。また、マクロファージは特定の信号2時には逆にM2表現型に活性化したM1から切り替え、することができます。
表現型に依存して、マクロファージは、異なる機能を有することになる。 M1マクロファージは、微生物または腫瘍細胞3を殺すために、例えば、腫瘍壊死因子α（TNF-α）などの炎症誘発性サイトカインを産生する細胞である。対照的に、M2マクロファージは、抗inflammatorを生成することによって創傷治癒および線維症のように、これらの炎症性反応を防ぐそのようなTGF-β-3,4-としてyの要因。
以前Boyum 6から適合技術を使用して5に記載のように、健康なドナーからのヒト末梢血単核細胞を、Ficoll密度勾配遠心分離によって単離した。培養中のマクロファージは、初代培養7の6日後、M1またはM2表現型に分化させることができる。
タンパク質発現またはそのような宿主または病原微生物毒素などの様々な制御された刺激の下でマクロファージ2つのサブタイプ間のタンパク質の変化の分析は、プロ – および抗炎症性マクロファージの機能を解読するために役立つであろう。
プロテオミクスは、具体的に上方または様々な刺激の下でヒト培養マクロファージにおけるダウンレギュレートされたタンパク質の直接監視のためのユニークなツールです。蛍光色素は、低感度画像解析8 <ように、2Dゲル電気泳動の制限のいくつかを解決した / SUP>。システイン残基と反応染料は、リジン残基9との反応に比べ、検出感度が増加している。以前の研究では、古典的な銀染色した2D電気泳動11に比べて少ない試料10の分析のためのDIGE飽和標識化の有用性を実証した。この技術は、急速にマクロファージの2サブタイプ間または同じサブタイプからの未処理および処理マクロファージ間のタンパク質修飾を分析するのに役立ちます。
このプロテオミクス手法の利点は、2Dゲル12を分析することによって、タンパク質のサイズおよび翻訳後修飾の情報へのアクセスを行っている。これは分析することができるサンプルの数を制限し、高スループット技術ではないことを考慮すべきである。最近13日のように、質量分析に基づくハイスループットアッセイの開発は、これを改善することができる。
_contentは ">ここでは、等電点電気泳動、電気泳動の過程を経て培養されたマクロファージのタンパク質抽出から2D DIGE解析を実行する方法を提示し、SDS-PAGE、ならびに適切な2Dソフトウェアの有用性に関する情報。Protocol
Representative Results
Discussion
本明細書中に記載されるプロトコルは、マクロファージ、M1（炎症誘発性）およびM2（抗炎症性）の2つのサブタイプの種々の刺激の影響を分析するための方法を詳述する。以前に公開され7 M1及びM2マクロファージの初代培養物は、単球の分化から得た。
2D DIGEゲル電気泳動の手順は、Cy3およびCy5の励起/発光波長で2回ゲルを走査するために、SDS-PAGEのために、低蛍?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by Inserm. Marion Bouvet is a fellow of the French Ministry for Research and Technology. Annie Turkieh is a fellow granted by European Union FP7 HOMAGE (305507).
Materials
| Name | Company | Catalog number |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 31870-074 |
| PBX 10 X | Invitrogen | 14200-083 |
| L-glutamine-200mM-100X | Invitrogen | 25030-024 |
| gentamycin 10 mg/mL | Invitrogen | 15710-049 |
| human serum | Invitrogen | 34005100 |
| Ficoll d=1,077 | ATGC | L6115 |
| Leucosep | Dutscher | 16760 |
| 6-wells plate PRIMARIA | Becton Dickinson | 353846 |
| IL-4 | Promocell | B-61410 |
| lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | L-2654 |
| Giemsa | Fluka | 48900 |
| EDTA MM372,2 | Research Organics | 3.00E+01 |
| Filter 0,22µm | Millipore | SCGPTORE |
| 100 mL cylinder | Corning | 430182 |
| TCEP | Interchim | UP242214 |
| Bradford reagent | Bio-Rad | 5000006 |
| Cy3+Cy5-reactive dye | GE Healthcare | 25-8009-83 |
| IPG strip 3-10 24cm | GE Healthcare | 17-6002-44 |
| Protean IEF cell | Bio-Rad | 165-4000 |
| Low-melting agarose | Invitrogen | 15517-014 |
| Ettan-Daltsix system | GE Healthcare | 80-6485-08 |
| Ettan DIGE Imager scanner | GE Healthcare | |
| Progenesis Samespot | Non linear dynamics | |
| 50 ml tubes | any supplier | n/a |
| 15 ml tubes | any supplier | n/a |
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C5070 |
| Urée | Merk | 108484-500 |
| Thiourée | Sigma-Aldrich | T7875 |
| DTT | Bio-Rad | 1610611 |
| APS | Sigma-Aldrich | A3678 |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | T3253 |
| Pharmalytes 3-10 | GE Healthcare | 17-0456-01 |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3773 |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G6279 |
| Acrylamide 40% | Bio-Rad | 161-0148 |
| 2D clean Up | GE Healthcare | 80-6454-51 |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 |
| Diméthylformamide | Sigma-Aldrich | 22705-6 |
| electrode wicks | Bio-Rad | 165-4071 |
References
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