Proteomikk Profilering av Makrofager av 2D elektroforese
Summary
Macrophages are the key cells involved in host pathogenicity. Macrophages display phenotypic and functional diversity that can be analysed and detected by proteomic analysis. This article describes how to perform 2D electrophoresis of primary cultures of human macrophages differentiated into M1 or M2 phenotype.
Abstract
The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The key role of macrophages has been shown in various pathological disorders such as inflammatory, immunological, and infectious diseases. In this protocol, we use primary cultures of human monocyte-derived macrophages that can be differentiated into the M1 (pro-inflammatory) or the M2 (anti-inflammatory) phenotype. This in vitro model is reliable for studying the biological activities of M1 and M2 macrophages and also for a proteomic approach. Proteomic techniques are useful for comparing the phenotype and behaviour of M1 and M2 macrophages during host pathogenicity. 2D gel electrophoresis is a powerful proteomic technique for mapping large numbers of proteins or polypeptides simultaneously. We describe the protocol of 2D electrophoresis using fluorescent dyes, named 2D Differential Gel Electrophoresis (DIGE). The M1 and M2 macrophages proteins are labelled with cyanine dyes before separation by isoelectric focusing, according to their isoelectric point in the first dimension, and their molecular mass, in the second dimension. Separated protein or polypeptidic spots are then used to detect differences in protein or polypeptide expression levels. The proteomic approaches described here allows the investigation of the macrophage protein changes associated with various disorders like host pathogenicity or microbial toxins.
Introduction
Makrofager er heterogene og plast celler som er i stand til å tilegne seg distinkte funksjonelle fenotyper. In vivo, disse cellene svare på et stort utvalg av mikro miljø signalssuch som mikrobielle produkter, cytokiner, osv. 1. In vitro, den pro-inflammatorisk fenotype (M1) av makrofager, kan induseres ved lipopolysakkarid (LPS) og den anti-inflammatoriske fenotype (M2) av enkelte cytokiner slik som interleukin-4 (IL-4). Videre kan makrofager bytte fra en aktivert M1 til M2 fenotype, og omvendt, avhengig av særskilte signaler 2.
Avhengig av fenotype, vil makrofager har forskjellige funksjoner. M1 makrofager er cellene som produserer pro-inflammatoriske cytokiner, slik som tumornekrosefaktor α (TNF-α), for å drepe mikroorganismer eller tumorceller 3. I kontrast, M2 makrofager hindre disse betennelsesreaksjon som i sårheling og fibrose ved å produsere anti-inflammatory faktorer som TGF-β 3,4.
Humane perifere mononukleære blodceller fra friske donorer ble isolert ved Ficoll-tetthetsgradient-sentrifugering som tidligere beskrevet 5 ved hjelp av en teknikk tilpasset fra Boyum 6. Makrofager i kultur kan differensieres i M1 eller M2 fenotype etter 6 dager med primær kultur 7.
Analyse av protein uttrykk eller proteinendringer mellom de to undertyper av makrofager under ulike kontrollerte stimuli, for eksempel verts patogenitet eller mikrobielle toksiner, vil være nyttig å tyde funksjonaliteten til pro- og anti-inflammatoriske makrofager.
Proteomikk er unike verktøy for direkte påvisning av proteiner som er spesielt opp- eller nedregulert i menneskelige dyrkede makrofager under ulike stimuli. Fluorescerende fargestoffer har løst noen av begrensningene i 2D gel elektroforese, slik som lav følsomhet og bildeanalyse 8 < / Sup>. De fargestoffer som reagerer med cysteinresiduer har økt følsomhet i forhold til de som reagerer med lysinrester 9. I en tidligere studie demonstrerte vi nytten av DIGE metnings merking for analysen av prøvene knappe 10 sammenlignet med den klassiske sølv-farget 2D-elektroforese 11. Denne teknologien er nyttig i raskt analysere protein modifikasjoner mellom de to undertyper av makrofager eller mellom ubehandlet og behandlet makrofager fra samme subtype.
Fordelene ved denne teknikk er proteomikk å ha tilgang til informasjon av protein størrelse og post-translasjonelle modifikasjoner ved å analysere 2D gel 12. Det bør tas hensyn til at dette ikke er en høy gjennomstrømning teknikk, noe som begrenser antallet prøver som kan analyseres. Utviklingen av store gjennomgangs analyser basert på massespektrometri som anmeldte nylig 13 kan forbedre dette.
_content "> Her presenterer vi hvordan du utfører 2D DIGE analyse fra protein utvinning av dyrkede makrofager gjennom prosesser av elektroforese, isoelectrofocusing, og SDS-PAGE samt informasjon om nytten av tilstrekkelig 2D programvare.Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen er beskrevet heri detaljer en metode for å analysere virkningen av ulike stimuli i de to undertyper av makrofager, M1 (pro-inflammatoriske) og M2 (anti-inflammatorisk). Primære kulturer av M1 og M2 makrofager ble oppnådd fra differensieringen av monocytter som tidligere publisert 7..
Prosedyren for 2D DIGE gel elektroforese krever spesialiserte materialer og utstyr, for eksempel IEF celle for isoelectrofocusing, lav-fluorescens plater for SDS-PAGE for å skanne to g…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by Inserm. Marion Bouvet is a fellow of the French Ministry for Research and Technology. Annie Turkieh is a fellow granted by European Union FP7 HOMAGE (305507).
Materials
| Name | Company | Catalog number |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 31870-074 |
| PBX 10 X | Invitrogen | 14200-083 |
| L-glutamine-200mM-100X | Invitrogen | 25030-024 |
| gentamycin 10 mg/mL | Invitrogen | 15710-049 |
| human serum | Invitrogen | 34005100 |
| Ficoll d=1,077 | ATGC | L6115 |
| Leucosep | Dutscher | 16760 |
| 6-wells plate PRIMARIA | Becton Dickinson | 353846 |
| IL-4 | Promocell | B-61410 |
| lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | L-2654 |
| Giemsa | Fluka | 48900 |
| EDTA MM372,2 | Research Organics | 3.00E+01 |
| Filter 0,22µm | Millipore | SCGPTORE |
| 100 mL cylinder | Corning | 430182 |
| TCEP | Interchim | UP242214 |
| Bradford reagent | Bio-Rad | 5000006 |
| Cy3+Cy5-reactive dye | GE Healthcare | 25-8009-83 |
| IPG strip 3-10 24cm | GE Healthcare | 17-6002-44 |
| Protean IEF cell | Bio-Rad | 165-4000 |
| Low-melting agarose | Invitrogen | 15517-014 |
| Ettan-Daltsix system | GE Healthcare | 80-6485-08 |
| Ettan DIGE Imager scanner | GE Healthcare | |
| Progenesis Samespot | Non linear dynamics | |
| 50 ml tubes | any supplier | n/a |
| 15 ml tubes | any supplier | n/a |
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C5070 |
| Urée | Merk | 108484-500 |
| Thiourée | Sigma-Aldrich | T7875 |
| DTT | Bio-Rad | 1610611 |
| APS | Sigma-Aldrich | A3678 |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | T3253 |
| Pharmalytes 3-10 | GE Healthcare | 17-0456-01 |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3773 |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G6279 |
| Acrylamide 40% | Bio-Rad | 161-0148 |
| 2D clean Up | GE Healthcare | 80-6454-51 |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 |
| Diméthylformamide | Sigma-Aldrich | 22705-6 |
| electrode wicks | Bio-Rad | 165-4071 |
References
- van Ginderachter, J. A., et al. Classical and alternative activation of mononuclear phagocytes: picking the best of both worlds for tumor promotion. Immunobiology. 211, (2006).
- Porcheray, F., et al. Macrophage activation switching: an asset for the resolution of inflammation. Clin. Exp. Immunol. 142, 481-489 (2005).
- Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).
- Mantovani, A., Locati, M., Vecchi, A., Sozzani, S., Allavena, P. Decoy receptors: a strategy to regulate inflammatory cytokines and chemokines. Trends Immunol. 22, 328-336 (2001).
- Pinet, F., et al. Morphology, homogeneity and functionality of human monocytes-derived macrophages. Cell. Mol. Biol. 49, 899-905 (2003).
- Boyum, A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1. 97, 77-89 (1968).
- Chinetti-Gbaguidi, G., et al. Human atherosclerotic plaque alternative macrophages display low cholesterol handling but high phagocytosis because of distinct activities of the PPARγ and LXRα pathways. Circ. Res. 108, 985-995 (2011).
- Tonge, R., et al. Validation and development of fluorescence two-dimensional differential gel electrophoresis proteomics technology. Proteomics. 1, 377-396 (2001).
- Shaw, J., et al. Evaluation of saturation labelling two-dimensional difference gel electrophoresis fluorescent dyes. Proteomics. 3, 1181-1195 (2003).
- Dupont, A., et al. Application of saturation dye 2D DIGE proteomics to characterize proteins modulated by oxidized low density lipoprotein treatment of human macrophages. J. Proteome Res. 7, 3572-3582 (2008).
- Dupont, A., et al. Two-dimensional maps and databases of the human macrophage proteome and secretome. Proteomics. 4, 1761-1778 (2004).
- Acosta-Martin, A. E., et al. Impact of incomplete DNase I treatment on human macrophage analysis. Proteomics Clin. Appl. 3, 1236-1246 (2009).
- Acosta-Martin, A. E., Lane, L. Combining bioinformatics and MS-based proteomics: clinical implications. Expert Rev Proteomics. , (2014).
- Boytard, L., et al. Role of proinflammatory CD68+MR- macrophages in peroxiredoxin-1 expression and in abdominal aortic aneurysms in humans. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 33, 431-438 (2013).
