Proteomik Profilering av makrofager från 2D elektrofores
Summary
Macrophages are the key cells involved in host pathogenicity. Macrophages display phenotypic and functional diversity that can be analysed and detected by proteomic analysis. This article describes how to perform 2D electrophoresis of primary cultures of human macrophages differentiated into M1 or M2 phenotype.
Abstract
The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The key role of macrophages has been shown in various pathological disorders such as inflammatory, immunological, and infectious diseases. In this protocol, we use primary cultures of human monocyte-derived macrophages that can be differentiated into the M1 (pro-inflammatory) or the M2 (anti-inflammatory) phenotype. This in vitro model is reliable for studying the biological activities of M1 and M2 macrophages and also for a proteomic approach. Proteomic techniques are useful for comparing the phenotype and behaviour of M1 and M2 macrophages during host pathogenicity. 2D gel electrophoresis is a powerful proteomic technique for mapping large numbers of proteins or polypeptides simultaneously. We describe the protocol of 2D electrophoresis using fluorescent dyes, named 2D Differential Gel Electrophoresis (DIGE). The M1 and M2 macrophages proteins are labelled with cyanine dyes before separation by isoelectric focusing, according to their isoelectric point in the first dimension, and their molecular mass, in the second dimension. Separated protein or polypeptidic spots are then used to detect differences in protein or polypeptide expression levels. The proteomic approaches described here allows the investigation of the macrophage protein changes associated with various disorders like host pathogenicity or microbial toxins.
Introduction
Makrofager är heterogena och plastceller som kan få olika funktionella fenotyper. In vivo, dessa celler svarar på ett stort antal mikromiljö signalssuch som mikrobiella produkter, cytokiner, etc. 1. In vitro, den pro-inflammatoriska fenotyp (M1) av makrofag kan induceras av lipopolysackarid (LPS) och den anti-inflammatoriska fenotypen (M2) av vissa cytokiner, såsom interleukin-4 (IL-4). Dessutom kan makrofager växla från en aktiverad M1 till M2 fenotyp, och omvänt, på specifika signaler 2.
Beroende på fenotypen, kommer makrofager har olika funktioner. M1 makrofager är celler som producerar proinflammatoriska cytokiner, såsom tumörnekrosfaktor α (TNF-α), för att döda mikroorganismer eller tumörceller 3. Däremot M2 makrofager hindra dessa inflammatoriska svaret som i sårläkning och fibros genom att producera anti-inflammatory faktorer såsom TGF-β 3,4.
Humana perifera blodmononukleära celler från friska donatorer isolerades genom Ficoll-densitetsgradientcentrifugering såsom tidigare beskrivits 5 med användning av en teknik som anpassas från Boyum 6. Makrofager i kultur kan differentieras till M1 eller M2 fenotyp efter 6 dagars primär kultur 7.
Analys av proteinuttryck eller proteinförändringar mellan de två subtyper av makrofager under olika kontrollerade stimuli, till exempel värd patogenicitet eller mikrobiella toxiner, kommer att vara till hjälp för att dechiffrera funktionalitet pro- och antiinflammatoriska makrofager.
Proteomics är unika verktyg för direkt övervakning av proteiner som är specifikt upp- eller nedregleras i mänskliga odlade makrofager under olika stimuli. Fluorescerande färgämnen har löst vissa av de begränsningar av 2D-gelelektrofores, såsom låg känslighet och bildanalys 8 < / Sup>. De färgämnen som reagerar med cysteinrester har ökade detektionskänsligheten jämfört med de som reagerar med lysinrester 9. I en tidigare studie visade vi nyttan av Dige mättnadsmärkning för analys av knappa prover 10 jämfört med den klassiska silverfärgade 2D elektrofores 11. Denna teknik är till hjälp för snabb analys av proteinmodifieringar mellan de två subtyper av makrofager eller mellan obehandlade och behandlade makrofager från samma subtyp.
Fördelarna med denna proteomic teknik är att ha tillgång till den information om proteinstorlek och posttranslationella modifieringar genom att analysera 2D-gel 12. Det bör tas hänsyn till att detta inte är en hög genomströmning teknik, vilket begränsar det antal prov som kan analyseras. Utvecklingen av high throughput analyser baserade på masspektrometri som granskas nyligen 13 kan förbättra den här.
_content "> Här presenterar vi hur man utför 2D Dige analys från protein utvinning av odlade makrofager genom processerna för elektrofores, isoelectrofocusing och SDS-PAGE samt information om nyttan av adekvat 2D mjukvara.Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollet som beskrivs häri detaljer en metod för att analysera effekterna av olika stimuli för de två subtyper av makrofager, M1 (pro-inflammatorisk) och M2 (antiinflammatoriskt). Primära kulturer av M1 och M2 makrofager erhölls från differentieringen av monocyter som tidigare publicerats 7.
Förfarandet i 2D Dige gelelektrofores kräver speciella material och utrustning, som IEF cell för isoelectrofocusing, låg fluorescens plattor för SDS-PAGE för att skanna dubbelt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by Inserm. Marion Bouvet is a fellow of the French Ministry for Research and Technology. Annie Turkieh is a fellow granted by European Union FP7 HOMAGE (305507).
Materials
| Name | Company | Catalog number |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 31870-074 |
| PBX 10 X | Invitrogen | 14200-083 |
| L-glutamine-200mM-100X | Invitrogen | 25030-024 |
| gentamycin 10 mg/mL | Invitrogen | 15710-049 |
| human serum | Invitrogen | 34005100 |
| Ficoll d=1,077 | ATGC | L6115 |
| Leucosep | Dutscher | 16760 |
| 6-wells plate PRIMARIA | Becton Dickinson | 353846 |
| IL-4 | Promocell | B-61410 |
| lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | L-2654 |
| Giemsa | Fluka | 48900 |
| EDTA MM372,2 | Research Organics | 3.00E+01 |
| Filter 0,22µm | Millipore | SCGPTORE |
| 100 mL cylinder | Corning | 430182 |
| TCEP | Interchim | UP242214 |
| Bradford reagent | Bio-Rad | 5000006 |
| Cy3+Cy5-reactive dye | GE Healthcare | 25-8009-83 |
| IPG strip 3-10 24cm | GE Healthcare | 17-6002-44 |
| Protean IEF cell | Bio-Rad | 165-4000 |
| Low-melting agarose | Invitrogen | 15517-014 |
| Ettan-Daltsix system | GE Healthcare | 80-6485-08 |
| Ettan DIGE Imager scanner | GE Healthcare | |
| Progenesis Samespot | Non linear dynamics | |
| 50 ml tubes | any supplier | n/a |
| 15 ml tubes | any supplier | n/a |
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C5070 |
| Urée | Merk | 108484-500 |
| Thiourée | Sigma-Aldrich | T7875 |
| DTT | Bio-Rad | 1610611 |
| APS | Sigma-Aldrich | A3678 |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | T3253 |
| Pharmalytes 3-10 | GE Healthcare | 17-0456-01 |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3773 |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G6279 |
| Acrylamide 40% | Bio-Rad | 161-0148 |
| 2D clean Up | GE Healthcare | 80-6454-51 |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 |
| Diméthylformamide | Sigma-Aldrich | 22705-6 |
| electrode wicks | Bio-Rad | 165-4071 |
References
- van Ginderachter, J. A., et al. Classical and alternative activation of mononuclear phagocytes: picking the best of both worlds for tumor promotion. Immunobiology. 211, (2006).
- Porcheray, F., et al. Macrophage activation switching: an asset for the resolution of inflammation. Clin. Exp. Immunol. 142, 481-489 (2005).
- Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).
- Mantovani, A., Locati, M., Vecchi, A., Sozzani, S., Allavena, P. Decoy receptors: a strategy to regulate inflammatory cytokines and chemokines. Trends Immunol. 22, 328-336 (2001).
- Pinet, F., et al. Morphology, homogeneity and functionality of human monocytes-derived macrophages. Cell. Mol. Biol. 49, 899-905 (2003).
- Boyum, A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1. 97, 77-89 (1968).
- Chinetti-Gbaguidi, G., et al. Human atherosclerotic plaque alternative macrophages display low cholesterol handling but high phagocytosis because of distinct activities of the PPARγ and LXRα pathways. Circ. Res. 108, 985-995 (2011).
- Tonge, R., et al. Validation and development of fluorescence two-dimensional differential gel electrophoresis proteomics technology. Proteomics. 1, 377-396 (2001).
- Shaw, J., et al. Evaluation of saturation labelling two-dimensional difference gel electrophoresis fluorescent dyes. Proteomics. 3, 1181-1195 (2003).
- Dupont, A., et al. Application of saturation dye 2D DIGE proteomics to characterize proteins modulated by oxidized low density lipoprotein treatment of human macrophages. J. Proteome Res. 7, 3572-3582 (2008).
- Dupont, A., et al. Two-dimensional maps and databases of the human macrophage proteome and secretome. Proteomics. 4, 1761-1778 (2004).
- Acosta-Martin, A. E., et al. Impact of incomplete DNase I treatment on human macrophage analysis. Proteomics Clin. Appl. 3, 1236-1246 (2009).
- Acosta-Martin, A. E., Lane, L. Combining bioinformatics and MS-based proteomics: clinical implications. Expert Rev Proteomics. , (2014).
- Boytard, L., et al. Role of proinflammatory CD68+MR- macrophages in peroxiredoxin-1 expression and in abdominal aortic aneurysms in humans. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 33, 431-438 (2013).
