تسخير الطلب Bioorthogonal معكوس الكترون ديلز-ألدر الإضافة الحلقية لPretargeted PET التصوير

Summary

The bioorthogonal inverse electron demand Diels-Alder cycloaddition has been harnessed to create an effective and modular pretargeted PET imaging strategy for cancer. In this protocol, the steps of this methodology are described in the context of a model system employing the colorectal cancer targeted antibody huA33 and a ⁶⁴Cu-labeled radioligand.

Abstract

Due to their exquisite affinity and specificity, antibodies have become extremely promising vectors for the delivery of radioisotopes to cancer cells for PET imaging. However, the necessity of labeling antibodies with radionuclides with long physical half-lives often results in high background radiation dose rates to non-target tissues. In order to circumvent this issue, we have employed a pretargeted PET imaging strategy based on the inverse electron demand Diels-Alder cycloaddition reaction. The methodology decouples the antibody from the radioactivity and thus exploits the positive characteristics of antibodies, while eschewing their pharmacokinetic drawbacks. The system is composed of four steps: (1) the injection of a mAb-trans-cyclooctene (TCO) conjugate; (2) a localization time period during which the antibody accumulates in the tumor and clears from the blood; (3) the injection of the radiolabeled tetrazine; and (4) the in vivo click ligation of the components followed by the clearance of excess radioligand. In the example presented in the work at hand, a ⁶⁴Cu-NOTA-labeled tetrazine radioligand and a trans-cyclooctene-conjugated humanized antibody (huA33) were successfully used to delineate SW1222 colorectal cancer tumors with high tumor-to-background contrast. Further, the pretargeting methodology produces high quality images at only a fraction of the radiation dose to non-target tissue created by radioimmunoconjugates directly labeled with ⁶⁴Cu or ⁸⁹Zr. Ultimately, the modularity of this protocol is one of its greatest assets, as the trans-cyclooctene moiety can be appended to any non-internalizing antibody, and the tetrazine can be attached to a wide variety of radioisotopes.

Introduction

على مدى السنوات الثلاثين الماضية، أصبح التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني (PET) أداة لا غنى عنها السريرية في تشخيص وإدارة من السرطان. لطالما اعتبرت الأجسام المضادة ناقلات واعدة لتسليم النظائر المشعة الباعثة للبوزيترون لأورام بسبب تقارب رائعة وخصوصية لالمؤشرات الحيوية للسرطان. ^1،2 ومع ذلك، فإن بطيئة نسبيا الدوائية في الجسم الحي من الأجسام المضادة ولايات استخدام النظائر المشعة مع عدة أيام المادية نصف حياة. وهذا يمكن الجمع تسفر الجرعات الإشعاعية العالية إلى الأجهزة غير المستهدفة من المرضى، وهي المضاعفات المهمة التي هي ذات الأهمية السريرية منذ يتم حقن radioimmunoconjugates عن طريق الوريد، وبالتالي – على عكس جزئية بمسح الجسم CT – نتيجة في جرعات استيعابها في كل جزء من أجزاء الجسم، بغض النظر عن الأنسجة للاستجواب.

من أجل تجاوز هذه المسألة، فقد تم تخصيص جهد كبير لdevelopment استراتيجيات التصوير PET أن فصل النظائر المشعة وشاردة الاستهداف، وبالتالي الاستفادة من خصائص مفيدة من الأجسام المضادة في حين التفاف على القيود في وقت واحد الدوائية الذاتية الخاصة بهم. هذه الاستراتيجيات – يطلق في معظم الأحيان pretargeting أو استهداف متعددة الخطوات – وعادة ما تستخدم أربع خطوات: (1) ادارة جسم مضاد قادر على حد سواء المستضد وجين مشع ملزمة؛ (2) تراكم الأجسام المضادة في الأنسجة المستهدفة وإزالة لها من الدم. (3) إدارة لجين مشع جزيء صغير. و (4) ربط في الجسم الحي من جين مشع إلى الأجسام المضادة التي تتبعها التخليص السريع للجين مشع الزائد. ^3-8 وفي بعض الحالات، يتم حقن عامل المقاصة إضافية بين الخطوتين 2 و 3 من أجل الإسراع في إفراز الأجسام المضادة أي التي لم لربط الورم ويبقى في الدم. ⁵

وبشكل عام، TWأنواع س استراتيجيات pretargeting هي الأكثر انتشارا في الأدب. في حين أثبتت كلا ناجحة في النماذج قبل السريرية، كما أنها تمتلك القيود الرئيسية التي أعاقت تطبيق السريرية الخاصة بهم. وتعتمد الاستراتيجية الأولى على تقارب عالية بين الأجسام المضادة streptavidin مترافق وradiolabels المعدلة البيوتين. ومع ذلك، فقد أثبتت المناعية للأجسام المعدلة streptavidin وجود مشكلة مقلقة فيما يتعلق الترجمة. ^5،6،9،10 الاستراتيجية الثانية، في المقابل، توظف الأجسام المضادة bispecific التي تم هندستها وراثيا لربط كل من السرطان مستضد العلامات البيولوجية وناشبة رديولبلد جزيء صغير. ^3،11-14 في حين أن هذا الطريق الأخير هو بالتأكيد الإبداعي وانطباقها اسع محدودة بسبب التعقيد، وحساب، وعدم وجود نمطية للنظام.

مؤخرا، قمنا بتطوير ونشر منهجية التصوير PET pretargeted بناء على الطلب معكوس الإلكترون ديلز-ألدر (IEDDA) رد فعل الإضافة الحلقية بين -cyclooctene العابرة (TCO) وtetrazine (TZ؛ الشكل 1) ¹¹ في حين أن رد الفعل نفسه كان معروفا منذ عقود، شهدت IEDDA الكيمياء نهضة في السنوات الأخيرة كأسلوب bioconjugation بنقرة والكيمياء، وكما يتضح من عمل رائع من مجموعات من رالف Weissleder، جوزيف فوكس، وبيتر كونتي وغيرها. وقد تم تطبيق ^12-15 وIEDDA الإضافة الحلقية في مجموعة واسعة من الإعدادات، بما في ذلك التصوير مضان مع الببتيدات، والأجسام المضادة، والجسيمات النانوية وكذلك التصوير النووي . مع كل radiohalogens وradiometals ^16-26 وربط عالية الغلة ونظيفة وسريعة (ك _1> 30،000 M ^-1 ثانية ^-1)، انتقائي، و- خطيرة -. bioorthogonal ²⁷ وعلى الرغم من عدد من أنواع نقرة الكيمياء – بما في ذلك أزيد آلكاين cycloadditions المحفز النحاس،-أزيد آلكاين cycloadditions-روجت سلالة، وشتاودينغر LIGations – هم bioorthogonal كذلك، هو مزيج فريد من حركية التفاعل بسرعة وbioorthogonality أن يجعل IEDDA الكيمياء ذلك مناسبة تماما لpretargeting التطبيقات في الكائنات كلها ^28،29 على طول هذه الخطوط، فمن المهم أن نلاحظ أن التقرير الأخير من وجهة نظرنا وكانت مختبرات يست الأولى لتطبيق IEDDA الكيمياء لpretargeting: نشأ التقرير الأول للتصوير pretargeted مع IEDDA من عمل روسين، وآخرون وظهرت منهجية SPECT بتوظيف ¹¹¹ tetrazine في المسمى ^30.

كما ناقشنا أعلاه، فإن منهجية pretargeting أربعة خطوات بسيطة إلى حد ما (الشكل 2). في البروتوكول في متناول اليد، ويمكن وصفها استراتيجية pretargeted للتصوير PET من سرطان القولون والمستقيم التي توظف ⁶⁴ النحاس وNOTA المسمى جين مشع tetrazine والمكورات تعديل TCO للأجسام المضادة huA33. ومع ذلك، في نهاية المطاف نمطية من هذه المنهجية هو واحد من غرام لهاتأكل الأصول، كما شاردة -cyclooctene المتحولة يمكن إلحاق أي الأجسام المضادة غير استيعاب، ويمكن أن تعلق tetrazine لمجموعة واسعة من المراسلين الإشعاعي.

Protocol

الأخلاق بيان: تم تنفيذ كافة من التجارب على الحيوانات في الجسم الحي وصفها وفقا لبروتوكول المعتمدة وفقا للمبادئ التوجيهية الأخلاقية للميموريال سلون كيترينج للسرطان مركز المؤسسي رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام (IACUC). …

Representative Results

الخطوات الثلاث الأولى من التجربة – تركيب TZ-BN-NOTA، والاقتران من TCO لhuA33، وradiolabeling من TZ-BN-NOTA بناء من (أرقام 3 و 4) – هي موثوق بها للغاية. في حالة الإجراء أعلاه، تم تصنيعه في بناء TZ-BN-NOTA في ارتفاع العائد والنقاء. تم تعديل الأجسام المضادة huA33 مع 4.2 ± 0.6 TCO / ماب، وكا…

Discussion

والميزة الرئيسية لهذه الاستراتيجية التصوير PET pretargeted هو أنه قادر على ترسيم الأورام مع الهدف إلى خلفية تباين الصورة في جزء فقط من الجرعة إشعاع الخلفية التي تنتجها الأجسام المضادة المسمى مباشرة. على سبيل المثال، في نظام التصوير سرطان القولون والمستقيم وصفها هنا، تم تو…

Materials

Tetrazine NHS Ester	Sigma-Aldrich	764701	Store at -80 °C
Trans-cyclooctene NHS Ester	Sigma-Aldrich	764523	Store at -80 °C
p-NH2-Bn-NOTA	Macrocyclics	B-601	Store at -80 °C