Pretargeted PET 영상에 대한 Bioorthogonal 역 전자 수요 딜스 - 알더 고리 모으고

Summary

The bioorthogonal inverse electron demand Diels-Alder cycloaddition has been harnessed to create an effective and modular pretargeted PET imaging strategy for cancer. In this protocol, the steps of this methodology are described in the context of a model system employing the colorectal cancer targeted antibody huA33 and a ⁶⁴Cu-labeled radioligand.

Abstract

Due to their exquisite affinity and specificity, antibodies have become extremely promising vectors for the delivery of radioisotopes to cancer cells for PET imaging. However, the necessity of labeling antibodies with radionuclides with long physical half-lives often results in high background radiation dose rates to non-target tissues. In order to circumvent this issue, we have employed a pretargeted PET imaging strategy based on the inverse electron demand Diels-Alder cycloaddition reaction. The methodology decouples the antibody from the radioactivity and thus exploits the positive characteristics of antibodies, while eschewing their pharmacokinetic drawbacks. The system is composed of four steps: (1) the injection of a mAb-trans-cyclooctene (TCO) conjugate; (2) a localization time period during which the antibody accumulates in the tumor and clears from the blood; (3) the injection of the radiolabeled tetrazine; and (4) the in vivo click ligation of the components followed by the clearance of excess radioligand. In the example presented in the work at hand, a ⁶⁴Cu-NOTA-labeled tetrazine radioligand and a trans-cyclooctene-conjugated humanized antibody (huA33) were successfully used to delineate SW1222 colorectal cancer tumors with high tumor-to-background contrast. Further, the pretargeting methodology produces high quality images at only a fraction of the radiation dose to non-target tissue created by radioimmunoconjugates directly labeled with ⁶⁴Cu or ⁸⁹Zr. Ultimately, the modularity of this protocol is one of its greatest assets, as the trans-cyclooctene moiety can be appended to any non-internalizing antibody, and the tetrazine can be attached to a wide variety of radioisotopes.

Introduction

지난 30 년 동안, 양전자 방출 단층 촬영 (PET)는 암의 진단 및 관리에 필수적인 임상 도구가되었다. 항체는 긴 암 바이오 마커에 ​​대한 그들의 절묘한 친화력과 특이성으로 인해 종양 양전자 방출 방사성 동위 원소의 전달을위한 유망한 벡터를 고려하고있다. 항체의 ^{1, 2} 단, 상대적으로 느린 생체 내 약물 동태는 여러 날에 방사성 동위 원소의 사용을 의무화 물리적 반감기. 부분 바디 CT 스캔 달리 – – 조합은 환자의 비 – 표적 기관, radioimmunoconjugates 정맥 따라서 주입되기 때문에 특히 임상 적 의의이다 중요한 합병증 높은 방사선 량을 수득 할 결과를 흡입 투여로 신체의 모든 부분에서, 심문 조직에 관계없이.

이 문제를 우회하기 위해 상당한 노력을 develo의 전념하고있다동시에 내재 약동학 적 한계를 둘러싸하면서함으로써 항체의 유리한 특성을 활용, 방사성 동위 원소 및 표적 부분을 분리 PET 영상 전략의 pment. 이러한 전략은 – 가장 자주 pretargeting 또는 다단계 타겟팅라고 – 전형적으로 네 단계를 채택한다 : (1) 항원 및 방사성 리간드를 모두 결합 할 수있는 항체의 투여; (2) 표적 조직 및 혈액에서 그 간극에서 항체의 축적; (3) 작은 분자 방사성 리간드의 투여; 및 (4)를 초과하는 방사성 리간드의 급속한 냄. 일부 경우에 ^3-8 이어 항체에 방사성 리간드의 생체 결찰은 추가적인 소거 에이전트는 항체의 배설을 촉진시키기 위해 단계 (2)와 (3) 사이에 주입된다 그 종양을 결합 아직 혈액에 남아 있습니다. ⁽⁵⁾

대체로, TW를 말하기pretargeting 전략의 O 유형은 문학에서 가장 널리 있습니다. 모두 전임상 모델에서 성공적으로 검증되었지만, 그들은 또한 임상 적용을 방해 한 키 제한을 갖는다. 첫 번째 전략은 스트렙 타비 딘 – 복합 항체와 비오틴 – 수정 방사능 표지 사이의 높은 친화력에 의존; 그러나, 스트렙 타비 딘 – 수정 항체의 면역 원성은 번역과 관련하여 우려되는 문제로 입증되었습니다. ^5,6,9,10 두 번째 전략은, 대조적으로, 암을 모두 결합하는 유전자 조작 된 특이 적 항체를 사용 후자의 경로가 확실히 창조적 인 반면 바이오 마커 항원과 작은 분자 방사성 동위 원소 표지 합텐. ^3,11-14은 광범위한 적용은 시스템의 모듈 방식의 복잡성, 비용 및 부족에 의해 제한됩니다.

최근에는 개발 (역 전자 수요 딜스 – 알더 I에 기초를 pretargeted PET 이미징 방법을 게시EDDA) 트랜스 -cyclooctene (TCO) 및 테트라 (Tz 일 사이의 고리 화 반응;.에 의해 예시 그림 1) ⁽¹¹⁾ 반응 자체가 수십 년 동안 알려져있다 동안은 IEDDA 화학은 클릭 화학 바이오 콘쥬 게이션 기술로 최근 몇 년 동안 르네상스를 경험하고있다 랄프 Weissleder, 조셉 폭스, 펩티드, 항체 및 나노 입자의 형광 이미지 등을 포함한 ^12-15 IEDDA의 고리가 설정의 넓은 범위에서 적용되었다. 다른 중에서 피터 콘티의 기의 매혹적인 작품뿐만 아니라 핵 이미징 .. ²⁷ bioorthogonal 클릭 화학의 종류의 숫자 동안 – 비판적 – radiohalogens 및 radiometals 모두 ^16-26 결찰은 항복 높은 깨끗하고 빠른 (K _1> 30,000 M ^-1 초 ^-1), 선택하고, – 구리 촉매 아 지드 – 알킨 cycloadditions, 변형 승진 아 지드 – 알킨 cycloadditions, 그리고 슈타 우 딩거 LIG 손해 포함관리 포인트 -. 그것은 전체 유기체에서 응용 프로그램을 pretargeting에 매우 적합 IEDDA 화학을하게 빠른 반응 속도와 bioorthogonality의 고유 한 조합뿐만 아니라 bioorthogonal있는이 라인을 따라 ^{28, 29,} 그것의 최근 보고서 것이 중요합니다 우리의 실험실 pretargeting에 IEDDA 화학을 첫 적용되지 않았습니다. IEDDA와 pretargeted 영상의 첫 번째 보고서는 Rossin의 작업, 등에서 일어나 ^(111)에 표지 테트라를 사용하는 SPECT 방법론을 기능을 갖춘 ^30.

우리는 상술 한 바와 같이, pretargeting 방법은 네 가지 매우 간단한 단계 (그림 2). 손 프로토콜, ⁶⁴ CU-NOTA 표지 된 방사성 리간드 및 테트라 huA33 항체의 TCO 변성 공액을 채용 대장 암 PET 이미징 pretargeted 전략을 설명한다. 그러나,이 방법의 궁극적 모듈화는 GR 중 하나입니다트랜스 -cyclooctene 잔기로서 eatest 자산은 비 내재화 항체에 추가 될 수 있고, 테트라 방사성 기자의 다양한 부착 될 수있다.

Protocol

윤리 선언문 : 설명 생체 내 동물 실험의 모든 승인 된 프로토콜과 기념 슬로안 케터링 암 센터의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 윤리적 지침에 따라 따라 수행 하였다. 의 Tz-BN-NOTA 1. 합성 작은 반응 용기에 600 μL의 NaHCO3 완충액 (0.1 M, pH를 8.1) 7 MG-NH 2 -Bn NOTA (1.25 X 10-2 밀리몰)을 용해. 용액의 pH를 확인합니다. 필요한 …

Representative Results

실험의 처음 세 단계 -의 Tz-BN-NOTA, huA33에 TCO의 접합의 합성과의 Tz-BN-NOTA의 방사성 표지는 (도 3 및도 4) 구성 – 매우 안정적. 상기 절차의 경우의 Tz-BN-NOTA 구조체는 고 수율 및 고순도로 합성 하였다. ~ huA33 항체는 4.2 ± 0.6 TCO / 단클론 항체로 수정하고, Tz 일-BN-NOTA은> 85 % 붕괴 보정 수율, 그리고 특정 활동> 99 % 방사 화학적 순도 정제 된 방사성 리간드를 얻을 수 (64) 구리와 방…

Discussion

이 PET pretargeted 촬상 전략의 주요 장점은 직접 표지 된 항체에 의해 생성 된 배경 방사선 량의 단지 일부만 타겟 간 배경 화상의 콘트라스트를 종양의 윤곽을 할 수 있다는 것이다. 예를 들어, 여기에 설명 된 대장 암 이미징 시스템에서, 급성 생체 분포 실험의 데이터는 표지 된 ⁶⁴ CU-NOTA-huA33 ⁸⁹ ZR-DFO-huA33 함께 ⁶⁴ Cu- 기 pretargeting 전략 선량 계산을 수행하는 데 사용 하였다. 임…

Materials

Tetrazine NHS Ester	Sigma-Aldrich	764701	Store at -80 °C
Trans-cyclooctene NHS Ester	Sigma-Aldrich	764523	Store at -80 °C
p-NH2-Bn-NOTA	Macrocyclics	B-601	Store at -80 °C