Aproveitando a demanda Bioorthogonal Inverse Electron Diels-Alder para Pretargeted PET Imagem

Summary

The bioorthogonal inverse electron demand Diels-Alder cycloaddition has been harnessed to create an effective and modular pretargeted PET imaging strategy for cancer. In this protocol, the steps of this methodology are described in the context of a model system employing the colorectal cancer targeted antibody huA33 and a ⁶⁴Cu-labeled radioligand.

Abstract

Due to their exquisite affinity and specificity, antibodies have become extremely promising vectors for the delivery of radioisotopes to cancer cells for PET imaging. However, the necessity of labeling antibodies with radionuclides with long physical half-lives often results in high background radiation dose rates to non-target tissues. In order to circumvent this issue, we have employed a pretargeted PET imaging strategy based on the inverse electron demand Diels-Alder cycloaddition reaction. The methodology decouples the antibody from the radioactivity and thus exploits the positive characteristics of antibodies, while eschewing their pharmacokinetic drawbacks. The system is composed of four steps: (1) the injection of a mAb-trans-cyclooctene (TCO) conjugate; (2) a localization time period during which the antibody accumulates in the tumor and clears from the blood; (3) the injection of the radiolabeled tetrazine; and (4) the in vivo click ligation of the components followed by the clearance of excess radioligand. In the example presented in the work at hand, a ⁶⁴Cu-NOTA-labeled tetrazine radioligand and a trans-cyclooctene-conjugated humanized antibody (huA33) were successfully used to delineate SW1222 colorectal cancer tumors with high tumor-to-background contrast. Further, the pretargeting methodology produces high quality images at only a fraction of the radiation dose to non-target tissue created by radioimmunoconjugates directly labeled with ⁶⁴Cu or ⁸⁹Zr. Ultimately, the modularity of this protocol is one of its greatest assets, as the trans-cyclooctene moiety can be appended to any non-internalizing antibody, and the tetrazine can be attached to a wide variety of radioisotopes.

Introduction

Ao longo dos últimos trinta anos, a tomografia por emissão de pósitrons (PET) tornou-se uma ferramenta indispensável para o diagnóstico e tratamento do câncer. Os anticorpos têm sido considerados promissores vectores para a entrega de radioisótopos emissores de positrões para tumores devido à sua afinidade e especificidade para requintado biomarcadores de cancro. ^1,2 farmacocinética No entanto, a relativamente lenta in vivo de anticorpos exige a utilização de radioisótopos com multi-dia semi-vidas físicas. Esta combinação pode render altas doses de radiação para os órgãos não-alvo de doentes, uma importante complicação que é de especial importância clínica desde radioimunoconjugados são injetados por via intravenosa e, portanto, – ao contrário de tomografias corpo parciais – resultado em doses absorvidas em cada parte do corpo, independentemente dos tecidos interrogados.

A fim de contornar este problema, esforço significativo foi dedicado ao desenvolvimento de estratégias de imagem PET que dissociar o radioisótopo e do grupo alvo, o que reforça as propriedades vantajosas de anticorpos contornando simultaneamente suas limitações farmacocinéticos intrínsecos. Estas estratégias – mais frequentemente denominado pr�marca�o ou segmentação de várias etapas – empregam tipicamente quatro passos: (1) a administração de um anticorpo capaz de se ligar tanto a um antigénio e um radioligando; (2) a acumulação de anticorpos no tecido-alvo e a sua depuração do sangue; (3) a administração de uma pequena molécula radioactivo; e (4) da ligação in vivo do ligando radioactivo ao anticorpo, seguido pela rápida eliminação do excesso de radioligando ^3-8 Em alguns casos., um agente de compensação adicional é injectado entre as etapas 2 e 3, a fim de acelerar a eliminação de qualquer anticorpo que ainda tem que se ligar o tumor e permanece no sangue. ⁵

Em termos gerais, twO tipos de estratégias pré-direccionamento são mais prevalentes na literatura. Embora ambos provaram ser um sucesso em modelos pré-clínicos, eles também possuem limitações fundamentais que têm impedido a sua aplicabilidade clínica. A primeira estratégia baseia-se na elevada afinidade entre os anticorpos e conjugados estreptavidina-radiomarcadores modificados com biotina; no entanto, a imunogenicidade dos anticorpos modificados com estreptavidina provou ser um problema preocupante no que diz respeito à tradução. ^5,6,9,10 A segunda estratégia, em contrapartida, utiliza anticorpos biespecíficos que foram geneticamente modificadas para se ligarem tanto um cancro antigénio biomarcador e um pequeno hapteno marcado radioactivamente molécula. ^3,11-14 Embora esta última via é certamente criativa, a sua ampla aplicabilidade é limitada pela complexidade, custo e falta de modularidade do sistema.

Recentemente, desenvolveu e publicou uma metodologia de imagem PET pretargeted baseado na procura de elétron inversa Diels-Alder (IEDDA) reação de cicloadição entre -cicloocteno trans (TCO) e tetrazina (Tz;. Figura 1) ¹¹ Embora a própria reação tem sido conhecida há décadas, IEDDA química experimentou um renascimento nos últimos anos como uma técnica bioconjugação clique química, como ilustrado pelo o trabalho fascinante dos grupos de Ralph Weissleder, Joseph Fox, e Peter Conti entre outros. ^12-15 A IEDDA cicloadição foi aplicado numa grande variedade de configurações, incluindo imagiologia por fluorescência com péptidos, anticorpos e nanopartículas, bem como imagiologia nuclear . com ambas radiohalogens e radiometais ^16-26 A ligação é de alto rendimento, limpo, rápido (k _1> 30.000 ^{M-1 s-1),} seletivo, e – criticamente -. bioorthogonal ²⁷ E, enquanto uma série de tipos de clique química – incluindo cicloadições catalisada por Cu azida-alcino, cicloadições azida-alcino promoveu-deformação e Staudinger ligções -. bioorthogonal estão bem, é a combinação única de cinética de reação rápida e bioorthogonality que faz IEDDA química tão bem adaptado para pr�marca�o aplicações em organismos inteiros ^28,29 Nesse sentido, é importante notar que o relatório recente da nossa laboratórios não foi o primeiro a aplicar IEDDA química para pr�marca�o: o primeiro relato da imagem pretargeted com IEDDA surgiu a partir do trabalho de Rossin, et al e contou com uma metodologia SPECT empregando um ¹¹¹ tetrazina Em marcado ^30..

Como discutimos acima, a metodologia pr�marca�o tem quatro passos bastante simples (Figura 2). No protocolo a mão, uma estratégia para a pretargeted imagens PET de cancro colo-rectal que emprega uma ⁶⁴ Cu-NOTE-radioligando marcado tetrazina e um conjugado de TCO-modificada do anticorpo huA33 será descrito. No entanto, em última análise, a modularidade desta metodologia é um dos seus grEatest activos, como a porção -cicloocteno trans pode ser adicionado a qualquer anticorpo não de internalização, e o tetrazina pode ser ligado a uma vasta variedade de repórteres radioactivos.

Protocol

ÉTICA DECLARAÇÃO: Todas as experiências com animais in vivo descritos foram realizados de acordo com um protocolo aprovado e sob as diretrizes éticas do Memorial Sloan Kettering Cancer Center, Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC). 1. Síntese de Tz-Bn-NOTA Num recipiente de reacção pequeno, dissolver 7 mg NH2-Bn-NOTE (1,25 x 10 ~ 2 mmol) em 600 ul de tampão de NaHCO3 (0,1 M, pH 8,1). Verificar o pH da…

Representative Results

Os três primeiros passos da experiência – a síntese de Tz-Bn-NOTA, a conjugação da TCO para huA33, e a marcação radioactiva do Tz-Bn-NOTE construir (Figuras 3 e 4) – são altamente fiáveis. No caso do processo acima descrito, o construto Tz-Bn-NOTE foi sintetizado com elevado rendimento e pureza. O anticorpo foi modificado com huA33 4,2 ± 0,6 TCO / mAb, e Tz-Bn-NOTE foi marcado radioactivamente com 64 Cu, para se obter o radioligando purificada em> 99% de pureza r…

Discussion

A principal vantagem desta estratégia de imagem PET pretargeted é que ele é capaz de delinear com tumores alvo-fundo-de contraste de imagem em apenas uma fracção da dose de radiação de fundo produzida por anticorpos marcados directamente. Por exemplo, no sistema de imagem do cancro colo-rectal descrito aqui, os dados obtidos em experiências de biodistribuição agudas foram utilizados para realizar os cálculos de dosimetria para a estratégia de pré-direccionamento com base de ^Cu-64, juntamente com …

Materials

Tetrazine NHS Ester	Sigma-Aldrich	764701	Store at -80 °C
Trans-cyclooctene NHS Ester	Sigma-Aldrich	764523	Store at -80 °C
p-NH2-Bn-NOTA	Macrocyclics	B-601	Store at -80 °C