Exploiter la demande Bioorthogonal inverse Electron Diels-Alder Cycloaddition pour préalablement visées PET Imaging

Summary

The bioorthogonal inverse electron demand Diels-Alder cycloaddition has been harnessed to create an effective and modular pretargeted PET imaging strategy for cancer. In this protocol, the steps of this methodology are described in the context of a model system employing the colorectal cancer targeted antibody huA33 and a ⁶⁴Cu-labeled radioligand.

Abstract

Due to their exquisite affinity and specificity, antibodies have become extremely promising vectors for the delivery of radioisotopes to cancer cells for PET imaging. However, the necessity of labeling antibodies with radionuclides with long physical half-lives often results in high background radiation dose rates to non-target tissues. In order to circumvent this issue, we have employed a pretargeted PET imaging strategy based on the inverse electron demand Diels-Alder cycloaddition reaction. The methodology decouples the antibody from the radioactivity and thus exploits the positive characteristics of antibodies, while eschewing their pharmacokinetic drawbacks. The system is composed of four steps: (1) the injection of a mAb-trans-cyclooctene (TCO) conjugate; (2) a localization time period during which the antibody accumulates in the tumor and clears from the blood; (3) the injection of the radiolabeled tetrazine; and (4) the in vivo click ligation of the components followed by the clearance of excess radioligand. In the example presented in the work at hand, a ⁶⁴Cu-NOTA-labeled tetrazine radioligand and a trans-cyclooctene-conjugated humanized antibody (huA33) were successfully used to delineate SW1222 colorectal cancer tumors with high tumor-to-background contrast. Further, the pretargeting methodology produces high quality images at only a fraction of the radiation dose to non-target tissue created by radioimmunoconjugates directly labeled with ⁶⁴Cu or ⁸⁹Zr. Ultimately, the modularity of this protocol is one of its greatest assets, as the trans-cyclooctene moiety can be appended to any non-internalizing antibody, and the tetrazine can be attached to a wide variety of radioisotopes.

Introduction

Au cours des trente dernières années, la tomographie par émission de positons (TEP) est devenu un outil clinique indispensable dans le diagnostic et le traitement du cancer. Des anticorps ont longtemps été considérés comme des vecteurs prometteurs pour la livraison de radio-isotopes émettant des positrons à des tumeurs en raison de leur affinité exquise et la spécificité de biomarqueurs du cancer. ^1,2 Toutefois, le relativement lents pharmacocinétique in vivo d'anticorps obligatoire l'utilisation de radio-isotopes avec multi-jours demi-vies physiques. Cette combinaison peut donner de fortes doses de rayonnement aux organes non-cibles de patients, une complication importante qui est d'une importance particulière clinique depuis radioimmunoconjugués sont injectés par voie intraveineuse et donc – contrairement partielles scans corps CT – résultat dans doses absorbées dans chaque partie du corps, quels que soient les tissus interrogés.

Afin de contourner ce problème, des efforts importants ont été consacrés à l'dévepement de stratégies d'imagerie PET dissociant le radio-isotope et la fraction de ciblage, se appuyant ainsi les propriétés avantageuses des anticorps en longeant simultanément leurs limites pharmacocinétiques intrinsèques. Ces stratégies – le plus souvent appelés préciblage ou ciblage en plusieurs étapes – utiliser habituellement quatre étapes: (1) l'administration d'un anticorps capable de se lier à la fois un antigène et un radioligand; (2) l'accumulation de l'anticorps dans le tissu cible et de son dégagement à partir du sang; (3) l'administration d'une petite radioligand molécule; et (4) la ligature in vivo du ligand radioactif à l'anticorps suivie de la clairance rapide de l'excès de radioligand. ^8.3 Dans certains cas, un agent de compensation supplémentaire est injecté entre les étapes 2 et 3 de façon à accélérer l'excrétion de tout anticorps qui n'a pas encore d'engager la tumeur et reste dans le sang. ⁵

D'une manière générale, two préciblage types de stratégies sont les plus répandus dans la littérature. Bien que les deux ont fait leurs preuves dans des modèles précliniques, ils possèdent aussi des limites clés qui ont empêché leur applicabilité clinique. La première stratégie se appuie sur la forte affinité entre les anticorps de streptavidine conjugué et radiomarqueurs de biotine modifiée; cependant, l'immunogénicité des anticorps de streptavidine modifiée se est avérée être un problème préoccupant en ce qui concerne la traduction. ^5,6,9,10 La seconde stratégie, au contraire, utilise des anticorps bispécifiques qui ont été modifiés par génie génétique pour se lier à la fois un cancer antigène de biomarqueurs et un petit haptène radiomarqué molécule. ^3,11-14 Bien que cette dernière voie est certainement créatif, sa large applicabilité est limitée par la complexité, le coût et le manque de modularité du système.

Récemment, nous avons élaboré et publié une méthode d'imagerie PET préalablement visées sur la base de la demande d'électrons inverse de Diels-Alder (IEDDA) de réaction de cycloaddition entre -cyclooctene trans (TCO) et tétrazine (Tz;. Figure 1) ¹¹ Bien que la réaction se est connu depuis des décennies, IEDDA chimie a connu une renaissance au cours des dernières années comme une technique de bioconjugaison click chemistry, comme illustré par le travail fascinant des groupes de Ralph Weissleder, Joseph Fox et Peter Conti entre autres. ^12-15 Le IEDDA cycloaddition a été appliquée dans un large éventail de paramètres, y compris l'imagerie de fluorescence avec des peptides, des anticorps, et des nanoparticules ainsi que l'imagerie nucléaire . avec les deux radiohalogens et radiométaux ^16-26 La ligature est un rendement élevé, propre, rapide (k _1> 30000 M ^-1 sec ^-1), sélective et – critique -. bioorthogonal ²⁷ Et si un certain nombre de types de chimie clic – y compris azoture alcyne cycloadditions de Cu-catalysée, cycloadditions azoture-alcyne contrainte promu, et Staudinger ligations -. bioorthogonal sont ainsi, ce est la combinaison unique de la cinétique de réaction rapides et bioorthogonality qui rend IEDDA chimie si bien adapté à préciblage applications dans des organismes entiers ^28,29 long de ces lignes, il est important de noter que le récent rapport de notre laboratoires ne était pas le premier à appliquer IEDDA chimie pour préciblage: le premier rapport de l'imagerie préalablement visées avec IEDDA née du travail de Rossin, et al et a présenté une méthodologie SPECT utilisant un ¹¹¹ tétrazine Dans marqué ^30..

Comme nous avons discuté ci-dessus, la méthodologie préciblage comporte quatre étapes assez simples (figure 2). Dans le protocole à portée de main, une stratégie préalablement visées pour l'imagerie PET du cancer colorectal qui emploie une Cu-NOTA radioligand marqué ⁶⁴ de tétrazine et un conjugué TCO modifiée de l'anticorps huA33 va être décrit. Cependant, en fin de compte la modularité de cette méthodologie est l'un de ses gractifs en mangeras, que la fraction -cyclooctene trans peuvent être ajoutés à tout anticorps non-internalisation et l'tétrazine peuvent être attachés à une grande variété de journalistes radioactives.

Protocol

ÉTHIQUE DECLARATION: Toutes les expériences in vivo d'animaux décrits ont été réalisés selon un protocole approuvé et selon les directives éthiques de la Memorial Sloan Kettering Cancer Center Institutional Animal Care et l'utilisation Comité (IACUC). 1. Synthèse de Tz-Bn-NOTA Dans un petit récipient de réaction, dissoudre 7 mg NH 2 Bn-NOTA (1,25 x 10 -2 mmol) dans 600 ul NaHCO 3 tampon (0,1 M…

Representative Results

Les trois premières étapes de l'expérience – la synthèse de Tz-Bn-NOTA, la conjugaison du TCO huA33 et le radiomarquage de la Tz-Bn-NOTA construire (figures 3 et 4) – sont très fiables. Dans le cas de la procédure ci-dessus, le produit d'assemblage Tz-Bn-NOTA a été synthétisé avec un rendement élevé et de pureté. L'anticorps huA33 a été modifié avec 4,2 ± 0,6 TCO / mAb et Tz-Bn-NOTA était marqué à 64 Cu pour donner le radioligand purifié dans&…

Discussion

Le principal avantage de cette stratégie d'imagerie par PET préalablement visées, ce est qu'il est capable de délimiter les tumeurs avec la cible et le contraste de l'image en arrière-plan seulement une fraction de la dose de rayonnement d'arrière-plan produit par les anticorps directement marqués. Par exemple, dans le système d'imagerie du cancer colorectal décrit ici, les données provenant des expériences de biodistribution aiguë ont été utilisées pour effectuer des calculs de dosim?…

Materials

Tetrazine NHS Ester	Sigma-Aldrich	764701	Store at -80 °C
Trans-cyclooctene NHS Ester	Sigma-Aldrich	764523	Store at -80 °C
p-NH2-Bn-NOTA	Macrocyclics	B-601	Store at -80 °C