プレターゲッティングPETイメージング用バイオ直交逆電子需要ディールスアルダー環化を活用

Summary

The bioorthogonal inverse electron demand Diels-Alder cycloaddition has been harnessed to create an effective and modular pretargeted PET imaging strategy for cancer. In this protocol, the steps of this methodology are described in the context of a model system employing the colorectal cancer targeted antibody huA33 and a ⁶⁴Cu-labeled radioligand.

Abstract

Due to their exquisite affinity and specificity, antibodies have become extremely promising vectors for the delivery of radioisotopes to cancer cells for PET imaging. However, the necessity of labeling antibodies with radionuclides with long physical half-lives often results in high background radiation dose rates to non-target tissues. In order to circumvent this issue, we have employed a pretargeted PET imaging strategy based on the inverse electron demand Diels-Alder cycloaddition reaction. The methodology decouples the antibody from the radioactivity and thus exploits the positive characteristics of antibodies, while eschewing their pharmacokinetic drawbacks. The system is composed of four steps: (1) the injection of a mAb-trans-cyclooctene (TCO) conjugate; (2) a localization time period during which the antibody accumulates in the tumor and clears from the blood; (3) the injection of the radiolabeled tetrazine; and (4) the in vivo click ligation of the components followed by the clearance of excess radioligand. In the example presented in the work at hand, a ⁶⁴Cu-NOTA-labeled tetrazine radioligand and a trans-cyclooctene-conjugated humanized antibody (huA33) were successfully used to delineate SW1222 colorectal cancer tumors with high tumor-to-background contrast. Further, the pretargeting methodology produces high quality images at only a fraction of the radiation dose to non-target tissue created by radioimmunoconjugates directly labeled with ⁶⁴Cu or ⁸⁹Zr. Ultimately, the modularity of this protocol is one of its greatest assets, as the trans-cyclooctene moiety can be appended to any non-internalizing antibody, and the tetrazine can be attached to a wide variety of radioisotopes.

Introduction

最後の30年間で、陽電子放射断層撮影（PET）は、癌の診断と管理に不可欠な臨床ツールとなっている。抗体は、長い癌バイオマーカーに対するそれらの絶妙な親和性および特異性に起因する腫瘍への陽電子放出放射性同位元素の送達のための有望なベクターであると考えられている。抗体の^1,2-しかしながら、比較的遅いインビボでの薬物動態は、複数日と放射性同位元素の使用を義務付け物理的半減期。この組み合わせは、患者の非標的器官、放射性免疫複合体を静脈内、したがって注入されるので、特定の臨床的意義のある重要な合併症に高い放射線量を得ることができる – 部分ボディCTスキャンとは異なり – 身体のあらゆる部分に吸収線量をもたらす、尋問組織の関係なく。

この問題を回避するためには、かなりの努力がdeveloに専念してきました同時に、それらの固有の薬物動態学的限界を幅木つつ抗体の有利な特性を活用し、放射性同位体と標的部分を切り離すPETイメージング戦略のpment。これらの戦略は-最も頻繁にプレターゲッティングまたは多段階のターゲティングと呼ばれる- 典型的には4つのステップを使用する：（1）抗原および放射性リガンドの両方に結合することができる抗体を投与する。 （2）標的組織及び血液からのそのクリアランスにおける抗体の蓄積。 （3）小分子、放射性リガンドを投与する。 （4）過剰な放射性リガンドの迅速なクリアランスによって。場合によっては^3-8続い抗体に対する放射性リガンドのインビボでの連結は、追加のクリアリング剤は、任意の抗体の排泄を促進するために、手順2と3の間に注入されるそれは、腫瘍をバインドするためにまだあり、血液中に残っている^。5

広義には、TWを話すプレターゲッティング戦略のO型は、文学の中で最も普及している。両方の前臨床モデルで成功を収めているが、それらはまた、それらの臨床適用を妨げている重要な制限を有する。最初の戦略は、ストレプトアビジン結合抗体およびビオチン修飾放射標識の間に高い親和性に依存しています。しかし、ストレプトアビジンで修飾された抗体の免疫原性は、翻訳に関して気になる問題があることが証明されている。 ^{メタノシクロオクタ}第二の戦略は、対照的に、癌の両方に結合するように遺伝子操作された二重特異性抗体を用いてバイオマーカー抗原と小分子、放射性標識ハプテン^。3,11-14この後者のルートは確かに創造的である一方、その広範な適用は複雑さ、費用、およびシステムのモジュール性の欠如によって制限されている。

最近、我々は、逆電子需要ディールス – アルダーに基づくプレターゲッティングPET画像化方法論を開発し、公開された（Iトランス -cyclooctene（TCO）とテトラジン（Tzの間EDDA）付加環化反応; 図^1）11反応自体は何十年も知られているがで示されるように、IEDDA化学は、クリック化学バイオコンジュゲーション技術として、近年、ルネッサンスを経験しているとりわけラルフ·ワスリーダー、ジョセフ·フォックス、そしてピーター·コンティのグループの魅力的な作品^。12-15 IEDDAの環は、蛍光ペプチドでのイメージング、抗体、およびナノ粒子だけでなく、核画像を含め、設定の広い範囲で適用されている。批判- -バイオ直交²⁷とクリックケミストリーの種類数ながら。放射性ハロゲンと放射性金属の両方で^16-26ライゲーションは高い収穫、清潔、迅速な（K _1>3万M ^-1秒^-1）、選択され、 -銅触媒によるアジド – アルキン付加環、ストレイン·昇格アジド – アルキン付加環、及びシュタウディンガーLIG含む管理ポイント- 。それは生物全体でアプリケーションをプレターゲッティングに適しとてもよくIEDDA化学を行い、反応速度が速くとbioorthogonalityのユニークな組み合わせであるだけでなく、バイオ直交であるこれらの線に沿って^28,29、それがあることを私たちの最近の報告に注意することが重要である研究所は、プレターゲッティングにIEDDA化学を適用することが第一ではなかった：IEDDAと予め標的イメージングの最初の報告は、 ら Rossin、の仕事から生じたと¹¹¹ In標識テトラジンを採用したSPECTの方法論を特色にした^30。。

我々は、上述のように、プレターゲッティング方法は、4つの非常に単純な手順（ 図2）を有している。手元プロトコルでは^、64のCu-NOTA標識テトラジン放射性リガンド及びhuA33抗体のTCO変性共役を用いた結腸直腸癌のPET画像化のためのプレターゲッティング戦略を説明する。しかし、最終的にはこの方法論のモジュールは、そのGRの一つですトランス -cyclooctene部分としてeatest資産は、非内在化抗体に付加することができ、テトラジン、放射性レポーターの多種多様に取り付けることができる。

Protocol

倫理STATEMENT：記載のin vivo動物実験のすべてが承認されたプロトコルとメモリアルスローンケタリングがんセンター施設内動物管理使用委員会（IACUC）の倫理指針の下で実施した。 TZ-BN-NOTAの1の合成小さ ​​な反応容器中で、600μlの飽和NaHCO 3緩衝液（0.1M、pHが8.1）に7mgのNH 2 -Bn-NOTA（1.25×10 -2ミリモル）を溶解する。溶?…

Representative Results

実験の最初の三つのステップ- TZ-BN-NOTA、huA33にTCOの結合の合成、およびTZ-BN-NOTAの放射性標識（ 図3、図4）を構築は-信頼性が高いです。上記の手順の場合には、Tzを-Bnは、NOTA構築物を高収率および高純度で合成した。 〜huA33抗体は4.2±0.6、TCO / mAbで変更された、とTZ-BN-NOTAは、> 85％の減衰補正後の収量、および比活性> 99％の放射化学的純度に精製された放射性リガンドを得る?…

Discussion

このプレターゲッティングPETイメージング戦略の主な利点は、直接標識された抗体によって生成バックグラウンド放射線量のほんの一部で標的対バックグラウンド画像コントラストを有する腫瘍の輪郭を描くことが可能であることである。例えば、ここに記載の結腸直腸癌のイメージングシステムにおいて、急性生体内分布実験からのデータは、直接標識された⁶⁴のCu-NOTA-huA33 ^89</s…

Materials

Tetrazine NHS Ester	Sigma-Aldrich	764701	Store at -80 °C
Trans-cyclooctene NHS Ester	Sigma-Aldrich	764523	Store at -80 °C
p-NH2-Bn-NOTA	Macrocyclics	B-601	Store at -80 °C