Utnytte Bioorthogonal Inverse Electron Demand Diels-Alder cykloaddisjon for Pretargeted PET Imaging

Summary

The bioorthogonal inverse electron demand Diels-Alder cycloaddition has been harnessed to create an effective and modular pretargeted PET imaging strategy for cancer. In this protocol, the steps of this methodology are described in the context of a model system employing the colorectal cancer targeted antibody huA33 and a ⁶⁴Cu-labeled radioligand.

Abstract

Due to their exquisite affinity and specificity, antibodies have become extremely promising vectors for the delivery of radioisotopes to cancer cells for PET imaging. However, the necessity of labeling antibodies with radionuclides with long physical half-lives often results in high background radiation dose rates to non-target tissues. In order to circumvent this issue, we have employed a pretargeted PET imaging strategy based on the inverse electron demand Diels-Alder cycloaddition reaction. The methodology decouples the antibody from the radioactivity and thus exploits the positive characteristics of antibodies, while eschewing their pharmacokinetic drawbacks. The system is composed of four steps: (1) the injection of a mAb-trans-cyclooctene (TCO) conjugate; (2) a localization time period during which the antibody accumulates in the tumor and clears from the blood; (3) the injection of the radiolabeled tetrazine; and (4) the in vivo click ligation of the components followed by the clearance of excess radioligand. In the example presented in the work at hand, a ⁶⁴Cu-NOTA-labeled tetrazine radioligand and a trans-cyclooctene-conjugated humanized antibody (huA33) were successfully used to delineate SW1222 colorectal cancer tumors with high tumor-to-background contrast. Further, the pretargeting methodology produces high quality images at only a fraction of the radiation dose to non-target tissue created by radioimmunoconjugates directly labeled with ⁶⁴Cu or ⁸⁹Zr. Ultimately, the modularity of this protocol is one of its greatest assets, as the trans-cyclooctene moiety can be appended to any non-internalizing antibody, and the tetrazine can be attached to a wide variety of radioisotopes.

Introduction

I løpet av de siste tretti årene har positronemisjonstomografi (PET) blitt et uunnværlig klinisk verktøy i diagnostisering og behandling av kreft. Antistoffer har lenge vært ansett som lovende vektorer for levering av positron-emitterende radioisotoper til svulster på grunn av deres utsøkte affinitet og spesifisitet for kreft biomarkører. ^1,2 er imidlertid den relativt langsomme in vivo farmakokinetikk antistoffer forlanger bruk av radioisotoper med flere dagers fysiske halveringstider. Denne kombinasjonen kan gi høye stråledoser til de ikke-målorganene av pasientene, en viktig komplikasjon som er av spesiell klinisk betydning siden radioimmunoconjugates injiseres intravenøst ​​og derfor – i motsetning dellegems CT-skanning – resultat i absorberte doser i alle deler av kroppen, uavhengig av avlest vev.

For å omgå dette problemet, har betydelig innsats vært dedikert til utvikledepment av PET avbildning strategier som isolerer radioisotop og målsøkende gruppe, og dermed utnytte fordelaktige egenskaper av antistoffer samtidig lister deres iboende farmakokinetiske begrensninger. Disse strategiene – oftest kalt pretargeting eller flertrinns målretting – anvender typisk fire trinn: (1) administrering av et antistoff som kan binde både et antigen og en radioligand; (2) akkumulering av antistoffet i målvevet og dets fjerning fra blodet; (3) at behandling av et lite molekyl radioligand; og (4) i in vivo-ligering av radioliganden til antistoffet etterfulgt ^3-8 I noen tilfeller ved hurtig fjerning av overskudd av radioligand., er en ytterligere clearingmiddel injiseres mellom trinnene 2 og 3 for å påskynde utskillelsen av enhver antistoff som har ennå å binde svulsten og forblir i blodet. ⁵

Stort sett two typer pretargeting strategier er mest utbredt i litteraturen. Mens begge har vist seg vellykket i prekliniske modeller, de også har viktige begrensninger som har hindret deres kliniske anvendbarhet. Den første strategien er avhengig av den høye affiniteten mellom streptavidin-konjugerte antistoffer og biotin-modifisert radiomarkører; har imidlertid immunogenisiteten av streptavidin-modifiserte antistoffer vist seg å være bekymringsfull problem med hensyn til oversettelse. ^5,6,9,10 Den andre strategi, i motsetning til dette anvender bispesifikke antistoffer som er blitt genetisk konstruert til å binde både en cancer biomarkør antigen og et lite molekyl radiomerket hapten. ^3,11-14 Selv om dette sistnevnte rute er absolutt kreativ, er dens brede anvendbarhet begrenset av kompleksitet, kostnader og mangel på modularitet av systemet.

Nylig har vi utviklet og utgitt en pretargeted PET avbildning metodikk basert på den inverse elektron etterspørsel Diels-Alder (jegEDDA) cykloaddisjon reaksjon mellom trans -cyclooctene (TCO) og tetrazine (Tz;. Figur 1) ¹¹ Mens reaksjonen i seg selv har vært kjent i flere tiår, har IEDDA kjemi opplevd en renessanse de siste årene som et klikk kjemi bioconjugation teknikk, som illustrert ved den fascinerende arbeidet i grupper av Ralph Weissleder, Joseph Fox, og Peter Conti blant andre. ^12-15 The IEDDA cykloaddisjon har blitt benyttet i en rekke innstillinger, inkludert fluorescens bildebehandling med peptider, antistoffer, og nanopartikler samt atom bildebehandling . med både radiohalogens og radiometaller ^16-26 Liger er høytytende, ren, rask (k _1> 30000 M ^-1 sek ^-1), selektive, og – kritisk -. bioorthogonal ²⁷ Og mens en rekke typer klikk kjemi – inkludert Cu-katalysert azid-alkyn cycloadditions, stamme forfremmet azid-alkyn cycloadditions og Staudinger lyasjon -. er bioorthogonal også, det er den unike kombinasjonen av raske reaksjonskinetikk og bioorthogonality som gjør IEDDA kjemi så godt egnet til pretargeting applikasjoner i hele organismer ^28,29 Langs disse linjene, er det viktig å merke seg at den siste rapporten fra vår laboratorier var ikke den første til å gjelde IEDDA kjemi til pretargeting: den første rapporten om pretargeted bildebehandling med IEDDA oppsto fra et verk av Rossin, et al og inneholdt en SPECT metodikk ansette en ^111-merket tetrazine ^30..

Som vi diskuterte ovenfor, har pretargeting metodikk fire ganske enkle trinn (figur 2). I protokollen for hånden, vil en pretargeted strategi for PET avbildning av tykktarmskreft som sysselsetter en ⁶⁴ Cu-NOTA-merket tetrazine radioligand og en TCO-modifisert konjugerte av huA33 antistoff beskrives. Men til syvende og sist den modularitet av denne metodikken er en av sitt greter av eiendeler, som trans -cyclooctene delen kan legges til enhver ikke-intern antistoff, og tetrazine kan festes til et bredt utvalg av radioaktive journalister.

Protocol

ETIKK UTTALELSE: Alle de in vivo dyreforsøk beskrevet ble utført i henhold til godkjent protokoll og under de etiske retningslinjene for Memorial Sloan Kettering Cancer Center Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC). 1. Syntese av Tz-Bn-NOTA I en liten reaksjonsbeholder oppløses 7 mg NH2 -Bn-NOTA (1,25 x -2 10 mmol) i 600 ul NaHCO3 buffer (0,1 M, pH 8,1). Kontroller pH-verdien av oppløsningen. Hvis nødvend…

Representative Results

De første tre trinn av forsøket – syntese av Tz-Bn-NOTA, konjugering av TCO til huA33, og radiomerking av Tz-Bn-NOTA konstruere (figurene 3 og 4) – er svært pålitelig. I tilfellet med fremgangsmåten ovenfor, ble Tz-Bn-NOTA konstruksjonen syntetiseres i høyt utbytte og renhet. Den huA33 antistoff ble modifisert med 4,2 ± 0,6 TCO / mAb, og Tz-Bn-NOTA ble radiomerket med 64 Cu for å gi det rensede radioligand i> 99% radiokjemisk renhet> 85% råte-korrigert utbytte,…

Discussion

Den prinsipielle fordel ved denne pretargeted PET avbildning strategien er at den er i stand til opptegning tumorer med target-til-bakgrunnsbildekontrasten på bare en brøkdel av den bakgrunnsstråling dose produsert ved direkte merkede antistoffer. For eksempel, i kolorektal kreft imaging system beskrevet her, data fra akutte biofordelingsstudier eksperimenter ble ansatt for å utføre dosimetri beregninger for ⁶⁴ Cu-baserte pretargeting strategi sammen med direkte-merket ⁶⁴ Cu-NOTA-huA33 og <sup…

Materials

Tetrazine NHS Ester	Sigma-Aldrich	764701	Store at -80 °C
Trans-cyclooctene NHS Ester	Sigma-Aldrich	764523	Store at -80 °C
p-NH2-Bn-NOTA	Macrocyclics	B-601	Store at -80 °C