<em> במבחנה</em> אנזימתי Assay למדוד תמלול עיכוב על ידי גליום (III) ו- H<sub> 3</sub> 5,10,15-טריס corroles (pentafluorophenyl)
Summary
גליום (III) 5,10,15- pentafluorophenylcorrole (טריס) והאנלוגי Freebase להציג cytotoxicity תא מייקרו הנמוך. כתב יד זה מתאר תגובת RNA שעתוק, RNA הדמיה עם ג'ל מוכתם ברומיד ethidium, ו- RNA כימות עם ספקטרוסקופיה UV-Vis, על מנת להעריך עיכוב שעתוק על ידי corroles ומדגימה שיטה פשוטה של הערכת נכסי מועמד אנטי-סרטני.
Abstract
כימותרפיה כרוכה לעתים קרובות סוכנים ציטוטוקסיות ספקטרום רחב עם תופעות לוואי רבים ומיקוד מוגבל. Corroles היא קבוצה של macrocycles tetrapyrrolic שתערוכת נכסי ההפרש cytostatic ורעילים לתאים בשורות תאים ספציפיים, בהתאם לזהות של מתכת chelated וקבוצות פונקציונליות. ההתנהגות הייחודית של corroles פונקציונליות לשורות תאים ספציפיות מציגה את האפשרות של כימותרפיה ממוקדת.
תרופות אנטי-סרטניות רבות מוערכות על ידי היכולת שלהם לעכב שעתוק RNA. כאן אנו מציגים פרוטוקול צעד-אחר-צעד לשעתוק RNA בנוכחות מעכבים ידועים ופוטנציאליים. ההערכה של מוצרי RNA של תגובת השעתוק על ידי ג'ל אלקטרופורזה ו- Vis UV ספקטרוסקופיה מספקת מידע על מאפיינים מעכבים של מועמדים פוטנציאליים ותרופה נגד הסרטן, עם שינויים assay, נוספים על מנגנון הפעולה שלהם.
קטןידוע על המנגנון המולקולרי של פעולה של cytotoxicity corrole. בניסוי זה, אנו רואים שני מתחמים corrole: גליום (III) 5,10,15- pentafluorophenylcorrole (טריס) (Ga (tpfc)) ואנלוגי Freebase 5,10,15- (טריס) pentafluorophenylcorrole (tpfc). Assay שעתוק RNA שימש לבדוק את המאפיינים המעכבים של corroles. חמש תגובות שעתוק הוכנו: DNA שטופל בactinomycin D, triptolide, Ga (tpfc), tpfc ב[ מורכב]: יחס [בסיס תבנית ה- DNA] של 0.01, בהתאמה, וקבוצת ביקורת.
תגובות השעתוק נותחו לאחר 4 שעות באמצעות ג'ל אלקטרופורזה agarose וספקטרוסקופיה UV-Vis. יש עיכוב ברור על ידי Ga (tpfc), actinomycin D, וtriptolide.
assay שעתוק RNA זה יכול להיות שונה כדי לספק פירוט מכניסטית יותר על ידי שינוי הריכוזים של המתחם אנטי-סרטני, DNA, או אנזים פולימראז, או על ידי דוגרים DNA פולימראז או עם המכלוליםXES לפני שעתוק RNA; שינויים אלה היו להבחין בין מנגנון עיכוב מעורב DNA או האנזים. הוספה המורכבת לאחר שעתוק RNA יכול לשמש כדי לבדוק אם המתחמים להשפיל או hydrolyze RNA. גם assay זה יכול לשמש כדי לחקור מועמדים אנטי-סרטניים נוספים.
Introduction
כימותרפיה כרוכה לעתים קרובות סוכנים ציטוטוקסיות ספקטרום רחב עם תופעות לוואי לא רצויים ומיקוד מוגבל, אך עם הבנה טובה יותר של ביולוגיה של הסרטן, יש ביקוש הולך וגובר לסוכנים אנטי-סרטניים ביעילות סרטן מיקוד גבוהה ופחות תופעות לוואי. 1 תאי סרטן אנושיים לעתים קרובות הופכים ל תלוי באונקוגן אחת מופעל או ביטוי יתר להישרדות 2 כך., תרופות אנטי-סרטניות רבות מוערכות על ידי היכולת שלהם לעכב שעתוק RNA. טיפולים החוסמים את הביטוי של גנים אלה הופכים יעילים בחיסול תאים סרטניים ומובילים למוות של תאים. 3 תאים שינו רגישים יותר להפרעות בשעתוק RNA מ המתאימים לתאים נורמלים. 4 תרופות נגד סרטן המעכבים שעתוק צפויים לעכב באופן סלקטיבי ביטוי של אונקוגנים הנדרשים לתאים הסרטניים לשרוד. כתוצאה מכך 5, אני שעתוק RNAnhibition היא דרך יעילה לאיתורם של מועמדי תרופה נגד הסרטן פוטנציאליים וללמוד עוד על מנגנון הפעולה שלהם. פרוטוקול זה מוכיח כי Ga (tpfc) מעכב שעתוק RNA באותו סדר כמו התרופות כימותרפיות actinomycin D וtriptolide; השוואות דומות יכולות להתבצע באמצעות פרוטוקול זה עם מועמדי תרופה נגד הסרטן אחרים. Actinomycin D הוא מעכב שעתוק RNA הנפוץ לטיפול בסרטן הריונית trophoblastic, סרטן אשכים, הסרטן של וילם, rhabdomyosacoma, וסרקומה 6 של יואינג. Actinomycin D נעשה שימוש בטיפול בסרטן במשך כמעט חמישים שנים מאז שאושר לראשונה על ידי ה- FDA ב1964.Triptolide הוא מעכב שעתוק סלקטיבית שנחקר במבחנה ובמודלים של בעלי חיים שונים נושאות גידולים במשך 30 שנים. 7
טבע macrocyclic amphiphilic של corroles מקנה יתרונות משמעותיים על פני כיתות סמים אחרות כגון מולקולות קטנות או ביולוגיs. 8-14 האופי macrocyclic מאפשר חדירות סלולריות שהוא גדול מהצפוי למולקולות גדולות כזה, והם גדולים מספיק כדי אינטראקציה עם משטחי macromolecular, כגון אלה של חלבונים. 8 Corroles ידוע ליצירת קומפלקסי noncovalent הדוקים עם מולקולות ביולוגיות וסמים. 10 בנוסף לcytotoxicity הטבועה של מסגרת corrole, אנחנו הוכחנו כי מעשי corrole פעיל מעץ כמולקולה מוביל לתרופות כימותרפיות, במיוחד דוקסורוביצין תרופת anthracycline intercalating-DNA. כאשר corrole פעיל מעץ היה coadministered עם דוקסורוביצין, שיפור של פי 3 ב -50 IC של דוקסורוביצין נצפה לDU-145 תאים. 9 מסגרת corrole היא יציבה ובעל תכונות ספיגה הקרינה טבועה ש, כאשר פונקציונליות, לעבור משמרות ספיגה ייחודיות שיכול לשמש לאפיון. 10 Functionalization של הפיגום לא מטבע affect מאפייני photophysical של corrole, 9-15 אבל, כפי שניתן לראות בcorrole פעיל מעץ, באופן סלקטיבי שינוי מסגרת corrole באופן משמעותי יכול לשנות את המאפיינים הביולוגיים שלה. 16 הערכנו בעבר שש metallocorroles נגד שבע שורות תאי הסרטן אנושיות. התוצאות מצביעות על כך שהרעילות לתאי סרטן אנושיים תלויה ביון הספציפי המתכת, כמו גם החלפת קבוצה פונקציונלית. לדוגמא, corroles גליום פעיל מעץ חווה ספיגה סלולרית גבוהה וחדר באופן סלקטיבי לתוך הגרעין של תאים במוח סרטן ערמונית גרורתי (DU-145); תאי סרטן באותו corrole, למרות שזה לא חודר לתוך הגרעין של שורות תאים אחרות, מציג cytotoxicity גדולה יותר לשד (MDA-MB-231), מלנומה (SK-MEL-28), ושחלות (OVCAR-3) מאשר ל סרטן הערמונית. 9
מבחני מבוססי תאים ראשוניים עולים כי תרכובות אלה מראים הבטחה כסוכנים טיפוליים אנטי-סרטניים, שגופת פיורדאחקירה אה למנגנון פעולה. עיכוב תמלול הוא ציין עם מתחמים אורגנו-מתכתיים מסוימים 17-27 ובקשנו לבחון את התהליך הזה כמנגנון אפשרי לציטוטוקסיות התנהגות של משפחת corrole. assay שעתוק זה מספק שיטה פשוטה, זולה, וקלילה להערכת עיכוב שעתוק, שיוביל למידע מפורט יותר על ההשפעות של מולקולות אלה בתאים חיים.
כאן, עיכוב השעתוק של גליום (III) 5,10,15- pentafluorophenylcorrole (טריס) (Ga (tpfc)) והאנלוגי Freebase 5,10,15- pentafluorophenylcorrole (טריס) (tpfc) (איור 1) נבדקים. בניגוד לכמה מתחמי מעבר מתכת, גליום (III) הוא חיזור פעיל ולכן אינו מעורב ישירות בתהליך חיזור של מסלולי מטבוליים המבוסס על חיזור. 28 בכל מקרה, גליום (III) אין להציג נכסים רעילים לתאים ונחקר למטרות טיפוליות. גליום הוא המתכת המבטיחה ביותר השנייה לתרופות אנטי-סרטניות לאחר פלטינה ועבר מחקרים וחקירות רבים; מלחי ניטראט וגליום כלוריד נבדקו במחקרים קליניים כנגד hepatoma, לימפומה, סרטן שלפוחית השתן, ומחלות אחרות. 29-34 גליום (III) לכן הוא מתאים ביותר ללימודי corrole נגד סרטן. נתונים ראשוניים מראים Ga (tpfc) וtpfc יש לי נמוך GI 50, ריכוז תרופת הצורך לעכב 50% מהתפשטות תאים מקסימליים, עם שורות תאי הסרטן שונות (ראה איור 2); זה מאשר את תוקפו של ניסויים נוספים על שני מתחמים אלה כדי לקבוע המאפיינים המעכבים שלהם. אנו משווים תרכובות אלו עם התרופות נגד הסרטן הנפוץ actinomycin D וtriptolide. Actinomycin D intercalates DNA, RNA מעכב התארכות, וגורם למות תאים בשורת תאים מסוימים בריכוזים picomolar 6,35-37 Triptolide הראה לעכב את צמיחת גידול.; הוא נקשר לXPB / ERCC3 האנושי, o למקטעגורם שעתוק f TFIIH, שהוביל לעיכוב של הפעילות השנייה RNA פולימראז. 6-7,38-40
בעוד שהוא מוכר שבcorroles תערוכת נכסים רעילים לתאים, קיים מעט מידע על המנגנונים השונים הנובעים מfunctionalization. עיכוב Corrole של שעתוק RNA היה מציע תובנה רבה יותר על יחסי הגומלין שלהם עם Biomacromolecules. מתחמים אחרים ידועים נקשרים ל- DNA, כגון dirhodium (II, II) מתחמים, כרום (III) מתחמים, רותניום (II) מתחמי polypyridyl, רודיום (III) מתחמים, ואחרים שונים, היו נתונים למבחני שעתוק RNA, 18 27 כתוצאה מכך ההבנה טובה יותר של יחסי הגומלין שלהם עם Biomacromolecules. ניסוי קליל וזמין באופן נרחב זו גם בדיקה ראשונית טובה על מנת להעריך את התכונות הרעילות של מולקולת נתונה ולקבוע אם בדיקות ביולוגיות נוסף ראויים. Assay שעתוק RNA גם מאפשר לשינויים רבים, כגון varying כמות המתחם או אנזימים המשמש; שינוי תקופת דגירה, זמן התגובה ונקודות זמן מדגם; ומשתנה באורך תבנית ה- DNA ורצף, בין משתנים אחרים של עניין, ובכך פוטנציאל לספק כמות גדולה של נתונים. assay שעתוק זה זמין גם בקלות כמו ערכות במחיר סביר עם כל מרכיבי התגובה ההכרחיים בתנאי, למרות שניתן לקנות רכיבים והכינו בנפרד. בניסויים אלה, אנו משתמשים בערכה זמינה מסחרי שידוע שיש תשואה גבוהה. 41
כדי להעריך עיכוב שעתוק, אנו משתמשים בשתי שיטות: ג'ל אלקטרופורזה agarose וספקטרוסקופיה UV-Vis. ג'ל אלקטרופורזה agarose היא שיטה פשוטה ויעילה להפרדה, זיהוי, וטיהור 0.5- לברי DNA ו- RNA 25 kb. 42 ספקטרוסקופיה UV-Vis ניתן להשתמש כדי לקבוע את הריכוז וטוהר RNA. 43
Protocol
Representative Results
Discussion
assay זה מוכיח כי התוספת של Ga (tpfc) מעכבת שעתוק RNA דומה ל- המתחמים נגד הסרטן מחייב DNA הידוע actinomycin D וtriptolide. ציטוטוקסיות ההתנהגות של Ga (tpfc) (GI 50 = 58.1-154.7 מיקרומטר) עשויה בשל המאפיינים המעכבים שלה. מאחר שלא עיכוב שעתוק נצפה בtpfc, cytotoxicity של tpfc היא לא בשל עיכוב שעתוק RNA אבל נגרמת…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנחנו מאוד מודים לד"ר סינדי נ 'צ'יו לעזרה עם ג'ל אלקטרופורזה, ואנדי ג'ואו ומיכאל Grodick לתרומתם הנדיבה של DNA ואנזים הגבלה. אנו בתודה להכיר פרופ 'ג' הית 'ופרופ' ד 'מגשש לגישה נדיבה לציוד וחומרים. אנו מודים לד"ר Karn Sorasaenee להצעות מועילות. אנו מודים מרי H. טאנג ליצירת האיור משמש בסקירה סכמטית בווידאו. מימון ניתן על ידי ג'ונסון אנד ג'ונסון וUSC Y86786.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Actinomycin D | Sigma-Aldrich | A1410 | Store at 2-8 °C , protect from light |
| Triptolide | Sigma-Aldrich | T3652 | Store at 2-8 °C , protect from light |
| nuclease-free H2O | Life Technologies | AM9938 | |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Life Technologies | AM1334 | Store at –20 °C |
| Ethidium Bromide | Sigma-Aldrich | E7637 | CAUTION: For proper handling procedures of ethidium bromide, please see: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667 |
| Tris Acetate | Sigma-Aldrich | T6025 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | EDS | |
| UltraPure Agarose | Life Technologies | 16500-100 | |
| mini Quick Spin RNA Columns | Roche Life Science | 11814427001 | Store at 2-8 °C , do not freeze |
| 1 kb DNA Ladder | New England Biolabs | N3232S | Store at –20 °C |
References
- Weinstein, I. B. Addiction to oncogenes—The Achilles heel of cancer. Science. 297, 63-64 (2002).
- Derheimer, F. A., Chang, C. W., Ljungman, M. Transcription inhibition: A potential strategy for cancer therapeutics. Eur. J. Cancer. 41 (16), 2569-2576 (2005).
- Koumenis, C., Giaccia, A. Transformed cells require continuous activity of RNA polymerase II to resist oncogene-induced apoptosis. Mol. Cell. Biol. 17 (12), 7306-7316 (1997).
- Stellrecht, C. M., Chen, L. S. Transcription Inhibition as a Therapeutic Target for Cancer. Cancers. 3 (4), 4170-4190 (2011).
- Bensaude, O. Inhibiting eukaryotic transcription: Which compound to choose? How to evaluate its activity. Transcription. 2 (3), 103-108 (2011).
- Liu, Q. Triptolide and its expanding multiple pharmacological functions. International Immunopharmacology. 11 (3), 377-383 (2011).
- Mahammed, A., Gray, H. B., Weaver, J. J., Sorasaenee, K., Gross, Z. Amphiphilic corroles bind tightly to human serum albumin. Bioconjugate Chemistry. 15 (4), 738-746 (2004).
- Lim, P. Differential cytostatic and cytotoxic action of metallocorroles against human cancer cells: Potential platforms for anticancer drug development. Chemical Research in Toxicology. 25 (2), 400-409 (2012).
- Bendix, J., Dmochowski, I. J., Gray, H. B., Mahammed, A., Simkhovich, L., Gross, Z. Structural, electrochemical, and photophysical properties of gallium(III) 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corrole. Angewandte Chemie-International Edition. 39 (22), 4048-4051 (2000).
- Hwang, J. Y., Gross, Z., Gray, H. B., Medina-Kauwe, L. K., Farkas, D. L. Ratiometric spectral imaging for fast tumor detection and chemotherapy monitoring in vivo. Journal of Biomedical Optics. 16 (6), 1-6 (2011).
- Agadjanian, H. Tumor detection and elimination by a targeted gallium corrole. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (15), 6105-6110 (2009).
- Hwang, J. Y. Photoexcitation of tumor-targeted corroles induces singlet oxygen-mediated augmentation of cytotoxicity. Journal of Controlled Release. 163 (3), 368-373 (2012).
- Hwang, J. Y., et al. Investigating photoexcitation-induced mitochondrial damage by chemotherapeutic corroles using multimode optical imaging. Journal of Biomedical Optics. 17 (1), 11 (2012).
- Hwang, J. Y. A Mechanistic Study of Tumor-Targeted Corrole Toxicity. Molecular Pharmaceutics. 8 (6), 2233-2243 (2011).
- Saltsman, I., Mahammed, A., Goldberg, I., Tkachenko, E., Botoshansky, M., Gross, Z. Selective substitution of corroles: Nitration, hydroformylation, and chlorosulfonation. Journal of the American Chemical Society. 124 (25), 7411-7420 (2002).
- Gershman, Z., Goldberg, I., Gross, Z. DNA Binding and Catalytic Properties of Positively Charged Corroles. Angewandte Chemie. 46 (23), 4320-4324 (2007).
- Fu, P. K., Bradley, P. M., Turro, C. Stabilization of duplex DNA structure and suppression of transcription in vitro by bis(quinone diimine) complexes of rhodium(III) and ruthenium(II). Inorganic Chemistry. 42 (3), 878-884 (2003).
- Sorasaenee, K., Fu, P. K. -. L., Angeles-Boza, A. M., Dunbar, K. R., Turro, C. Inhibition of Transcription in Vitro by Anticancer Active Dirhodium(II) Complexes. Inorg. Chem. 42 (4), 1267-1271 (2003).
- Aguirre, J. D., Lutterman, D. A., Angeles-Boza, A. M., Dunbar, K. R., Turro, C. Effect of axial coordination on the electronic structure and biological activity of dirhodium(II,II) complexes. Inorganic Chemistry. 46 (18), 7494-7502 (2007).
- Raja, N. S., Nair, B. U. Chromium(III) complexes inhibit transcription factors binding to DNA and associated gene expression. Toxicology. 251 (1-3), 61-65 (2008).
- Gao, F., Chen, X., Wang, J. Q., Chen, Y., Chao, H., Ji, L. N. In Vitro Transcription Inhibition by Ruthenium(II) Polypyridyl Complexes with Electropositive Ancillary Ligands. Inorganic Chemistry. 48 (13), 5599-5601 (2009).
- Chen, X., Gao, F., Zhou, Z. X., Yang, W. Y., Guo, L. T., Ji, L. N. Effect of ancillary ligands on the topoisomerases II and transcription inhibition activity of polypyridyl ruthenium(II) complexes. Journal of Inorganic Biochemistry. 104 (5), 576-582 (2010).
- Chen, X., Gao, F., Yang, W. Y., Sun, J., Zhou, Z. X., Ji, L. N. Effects of intercalative ligands on the DNA binding, DNA topoisomerase II and DNA transcription inhibition of polypyridyl ruthenium(II) complexes. Inorganica Chimica Acta. 378 (1), 140-147 (2011).
- Chen, X., Gao, F., Yang, W. Y., Zhou, Z. X., Lin, J. Q., Ji, L. N. Structure-activity relationship of polypyridyl ruthenium(II) complexes as DNA intercalators, DNA photocleavage reagents, and DNA topoisomerase and RNA polymerase inhibitors. Chemistry & Biodiveristy. 10 (3), 367-384 (2013).
- Chifotides, H. T., Fu, P. K., Dunbar, K. R., Turro, C. Effect of equatorial ligands of dirhodium(II,II) complexes on the efficiency and mechanism of transcription inhibition in vitro. Inorganic Chemistry. 43 (3), 1175-1183 (2004).
- Pauly, M., Kayser, I., Schmitz, M., Dicato, M., Del Guerzo, A., Kolber, I., Moucheron, C., Kirsch-De Mesmaeker, A. In vitro inhibition of gene transcription by novel photo-activated polyazaaromatic ruthenium(II) complexes. Chemical Communications. 10, 1086-1087 (2002).
- Richardson, D. R. Iron and gallium increase iron uptake from transferring by human melanoma cells: Further examination of the ferric ammonium citrate-activated iron uptake process. Biochimica et Biophysica Acta. 1536 (1), 43-54 (2001).
- Collery, P., Keppler, B., Madoulet, C., Desoize, B. Gallium in cancer treatment. Critical Reviews in Oncology / Hematology. 42 (3), 283-296 (2002).
- Hedley, D. W., Tripp, E. H., Slowiaczek, P., Mann, G. J. Effect of gallium on DNA synthesis by human T-cell lymphoblasts. Cancer Research. 48 (11), 3014-3018 (1988).
- Chitambar, C. R., Narasimhan, J., Guy, J., Sem, D. S., O’Brien, W. J. Inhibition of ribonucleotide reductase by gallium in murine leukemic L1210 cells. Cancer Research. 51, 6199-6201 (1991).
- Seidman, A. D. Continuous infusion gallium nitrate for patients with advanced refractory urothelial tract tumors. Cancer. 68, 2561-2565 (1991).
- Chitambar, C. R. Medical applications and toxicities of gallium compounds. International Journal of Environmental Research and Public Health. 7 (5), 2337-2361 (2010).
- Chitambar, C. R. Gallium-containing anticancer compounds. Future Medicinal Chemistry. 4 (10), 1257-1272 (2012).
- Trask, D. K., Muller, M. T. Stabilization of type I topoisomerase-DNA covalent complexes by actinomycin D. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (5), 1417-1421 (1988).
- Chang, T. C., Tsai, L. C., Hung, M. W., Chu, L. L., Chu, J. T., Chen, Y. C. Effects of transcription and translation inhibitors on a human gastric carcinoma cell line. Potential role of Bcl-X(S) in apoptosis triggered by these inhibitors. Biochemical Pharmacology. 53 (7), 969-977 (1997).
- Mischo, H. E., Hemmerich, P., Grosse, F., Zhang, S. Actinomycin D induces histone gamma-H2AX foci and complex formation of gamma-H2AX with Ku70 and nuclear DNA helicase II. The Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 9586-9594 (2005).
- Titov, D. V. XPB, a subunit of TFIIH, is a target of the natural product triptolide. Nature Chemical Biology. 7 (3), 182-188 (2011).
- Leuenroth, S. J., Crews, C. M. Triptolide-induced transcriptional arrest is associated with changes in nuclear substructure. Cancer Researcg. 68 (13), 5257-5266 (2008).
- Vispé, S. Triptolide is an inhibitor of RNA polymerase I and II-dependent transcription leading predominantly to down-regulation of short-lived mRNA. Molecular Cancer Therapeutics. 8 (10), 2780-2790 (2009).
- . MEGAscript T7 Transcription Kit User Guide. Current Protocols in Molecular Biology. , (2014).
- Fleige, S., Pfaffl, M. W. RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance. Molecular Aspects of Medicine. 27 (2-3), 126-139 (2006).
- . . Quick Spin Columns Protocol. , (2013).
- . . RNA quality control. , (2007).
- Sabris, R. W. . Handbook of biological dyes and stains: synthesis and industrial application. , (2010).
