Una<em> In Vitro</em> Enzimática Ensayo para medir la transcripción Inhibición por galio (III) y H<sub> 3</sub> 5,10,15-tris (pentafluorofenil) corroles
Summary
Galio (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole y su análogo freebase presentan baja citotoxicidad celular micromolar. Este manuscrito describe una reacción de transcripción de ARN, ARN de formación de imágenes con un gel teñido con bromuro de etidio, y la cuantificación de ARN con espectroscopía UV-Vis, con el fin de evaluar la inhibición de la transcripción por corroles y demuestra un método directo de la evaluación de propiedades contra el cáncer candidatos.
Abstract
La quimioterapia implica a menudo agentes citotóxicos de amplio espectro con muchos efectos secundarios y focalización limitada. Corroles son una clase de macrociclos tetrapirrólicos que exhiben propiedades citostáticos y citotóxicos diferenciales en líneas celulares específicas, dependiendo de las identidades del metal quelado y grupos funcionales. El comportamiento único de corroles funcionalizados hacia líneas celulares específicas introduce la posibilidad de quimioterapia dirigida.
Muchos medicamentos contra el cáncer son evaluados por su capacidad para inhibir la transcripción del ARN. Aquí se presenta un protocolo paso a paso para la transcripción del ARN en presencia de los inhibidores conocidos y potenciales. La evaluación de los productos de ARN de la reacción de transcripción por electroforesis en gel y espectroscopía de UV-Vis proporciona información sobre las propiedades inhibidoras de los posibles candidatos a fármacos contra el cáncer y, con modificaciones en el ensayo, más sobre su mecanismo de acción.
Pocose sabe sobre el mecanismo molecular de acción de la citotoxicidad corrole. En este experimento, se consideran dos compuestos corrole: galio (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (Ga (tpfc)) y analógica freebase 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (tpfc). Un ensayo de la transcripción del RNA se utilizó para examinar las propiedades inhibidoras de los corroles. Se prepararon cinco reacciones de transcripción: ADN tratado con actinomicina D, triptolida, Ga (tpfc), tpfc en una [complejo]: [base de ADN de la plantilla] relación de 0,01, respectivamente, y un control no tratado.
Se analizaron las reacciones de transcripción después de 4 horas utilizando electroforesis en gel de agarosa y espectroscopia UV-Vis. Hay clara inhibición por Ga (tpfc), actinomicina D, y triptolide.
Este ensayo de transcripción de ARN se puede modificar para proporcionar más detalles mecanicista variando las concentraciones del complejo contra el cáncer, el ADN, o enzima polimerasa, o incubando el ADN o polimerasa con el complexes antes de la transcripción de ARN; estas modificaciones podrían diferenciar entre un mecanismo de inhibición que implica el ADN o la enzima. Añadir el complejo después de la transcripción del RNA puede ser usado para probar si los complejos se degradan o hidrolizar el ARN. Este ensayo también se puede utilizar para estudiar los candidatos anticancerígenos adicionales.
Introduction
La quimioterapia implica a menudo agentes citotóxicos de amplio espectro con efectos secundarios no deseados y la orientación limitada, sin embargo, con una mayor comprensión de la biología del cáncer, existe una demanda cada vez mayor de agentes contra el cáncer con una mayor eficacia cáncer de metas y menos efectos secundarios. 1 las células cancerosas humanas se convierten en frecuencia depende de un solo oncogen activado o sobreexpresa para la supervivencia 2 Por lo tanto., muchos fármacos anticancerígenos son evaluados por su capacidad para inhibir la transcripción del ARN. Los tratamientos que bloquean la expresión de estos genes transformantes son eficaces en la eliminación de las células cancerosas y conducen a la muerte celular. 3 Las células transformadas son más sensibles a las alteraciones en la transcripción de ARN que son células normales correspondientes. 4 Los fármacos anticancerosos que inhiben la transcripción se espera que inhiben selectivamente la expresión de los oncogenes que son necesarias para la célula cancerosa para sobrevivir. 5 En consecuencia, i transcripción del ARNnhibition es una forma útil de identificar posibles candidatos a fármacos contra el cáncer y aprender más acerca de su mecanismo de acción. Este protocolo demuestra que Ga (tpfc) inhibe la transcripción del ARN en el mismo orden que los medicamentos de quimioterapia actinomicina D y triptolida; comparaciones similares se pueden hacer usando este protocolo con otros candidatos a fármacos contra el cáncer. Actinomicina D es un inhibidor de la transcripción de ARN comúnmente utilizado para tratar el cáncer gestacional trofoblástico, cáncer testicular, tumor de Wilms, rhabdomyosacoma y del sarcoma de Ewing 6. Actinomicina D ha sido utilizado en la terapia del cáncer durante casi cincuenta años desde que se aprobó por primera vez por la FDA en 1964.Triptolide es un inhibidor de la transcripción selectiva que ha sido investigado in vitro y en varios modelos animales portadores de tumores de 30 años. 7
La naturaleza macrocíclico anfifílico de corroles imparte ventajas significativas sobre otras clases de fármacos, tales como pequeñas moléculas o biológicos. 8-14 El carácter macrocíclico permite la permeabilidad celular que es mayor de lo esperado para tales moléculas grandes, y son lo suficientemente grandes como para interactuar con superficies macromoleculares, tales como las de las proteínas. 8 Corroles se conocen para formar complejos no covalentes apretados con biomoléculas y drogas. 10 Además de la citotoxicidad inherente del marco corrole, hemos demostrado que un sulfonados actos corrole como una molécula portadora para los agentes quimioterapéuticos, específicamente la antraciclina doxorrubicina, un medicamento ADN intercalante. Cuando el corrole sulfonado se administró junto con doxorubicina, se observó una mejora de 3 veces en la IC 50 de doxorubicina para DU-145 células. 9 El marco corrole es estable y tiene absorbancia y fluorescencia propiedades inherentes que, cuando funcionalizado, se someten a cambios de absorbancia únicas que puede ser utilizado para la caracterización. 10 Funcionalización del andamio no lo hace inherentemente affect las propiedades fotofísicas de la corrole, 9-15, pero, como se ha visto con un corrole sulfonado, modificando selectivamente el marco de la corrole puede cambiar sustancialmente sus propiedades biológicas. 16 Anteriormente evaluaron seis metallocorroles contra siete líneas celulares de cáncer humano. Los resultados indican que la toxicidad hacia las células de cáncer humano es dependiente de la ion metálico específico, así como la sustitución de grupo funcional. Por ejemplo, corroles galio sulfonados experimentaron alta captación celular y penetraron de forma selectiva en el núcleo de las células cerebrales del cáncer de próstata metastásico (DU-145); células de la misma corrole, aunque no penetra en el núcleo de otras líneas celulares, presenta una mayor citotoxicidad de mama (MDA-MB-231), melanoma (SK-MEL-28), y de ovario (OVCAR-3) de cáncer que para cáncer de próstata. 9
Ensayos basados en células iniciales indican que estos compuestos son prometedores como agentes terapéuticos contra el cáncer, que merece furthinvestigación er en el mecanismo de acción. La inhibición de la transcripción se observa con ciertos complejos organometálicos 17-27 y nos trató de examinar este proceso como un posible mecanismo para el comportamiento citotóxico de la familia corrole. Este ensayo de transcripción proporciona un método sencillo, barato y fácil de evaluar la inhibición de la transcripción, lo que conducirá a una información más detallada acerca de los efectos de estas moléculas en las células vivas.
Aquí, la inhibición de la transcripción de galio (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (Ga (tpfc)) y su análogo de base libre 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (tpfc) (Figura 1) son probados. A diferencia de algunos complejos de metales de transición, galio (III) es redox inactiva y por lo tanto no está involucrado directamente en el proceso redox de las rutas metabólicas redox basada. 28 Independientemente, galio (III) no exhibir propiedades citotóxicas y ha sido investigado con fines terapéuticos. El galio es el segundo metal más prometedor para la terapia contra el cáncer después de platino y ha sido objeto de muchos estudios e investigaciones; sales de nitrato y cloruro de galio se han evaluado en ensayos clínicos contra hepatoma, linfoma, cánceres de la vejiga, y otras enfermedades. 29-34 de galio (III) es por lo tanto ideal para el cáncer estudios corrole. Los datos iniciales muestran Ga (tpfc) y tpfc tener baja GI 50, la concentración necesaria de medicamentos para inhibir el 50% de la proliferación celular máxima, con varias líneas celulares de cáncer (véase la Figura 2); Esto confirma la validez de experimentos adicionales sobre estos dos compuestos para determinar sus propiedades inhibidoras. Comparamos estos compuestos con los medicamentos contra el cáncer común actinomicina D y triptólido. Actinomicina D se intercala ADN, ARN inhibe la elongación, e induce la apoptosis en cierta línea celular a concentraciones picomolares 6,35-37 triptolida se ha demostrado que inhibe el crecimiento del tumor.; se une a XPB / ERCC3 humano, una o subunidadfactor de transcripción f TFIIH, conduce a la inhibición de la actividad de la ARN polimerasa II. 6-7,38-40
Mientras que se sabe comúnmente que corroles exhiben propiedades citotóxicas, existe poca información sobre los diferentes mecanismos derivados de funcionalización. Inhibición Corrole de la transcripción del ARN ofrecería un mayor conocimiento sobre sus interacciones con biomacromoléculas. Otros complejos sabe que se unen al ADN, tales como dirrodio (II, II), complejos de cromo (III), rutenio (II) complejos polypyridyl, rodio (III), y varios otros, se sometieron a ensayos de transcripción de ARN, 18- 27 resulta en una mayor comprensión de sus interacciones con biomacromoléculas. Este experimento fácil y ampliamente disponible es también una buena prueba inicial para evaluar las propiedades de citotoxicidad de una molécula dada y determinar si merece más pruebas biológicas. El ensayo de transcripción de ARN también permite muchas modificaciones, tales como varying la cantidad de compuesto o las enzimas utilizadas; variando el período de incubación, tiempo de reacción y los puntos de tiempo de la muestra; y variando la longitud de la plantilla de ADN y la secuencia de, entre otras variables de interés, por tanto, potencialmente proporcionando una gran cantidad de datos. Este ensayo de transcripción es también fácilmente disponibles como kits asequibles con todos los componentes de reacción necesarios previstos, aunque los componentes pueden ser comprados y preparados individualmente. En estos experimentos, se utiliza un kit disponible comercialmente conocido por tener un alto rendimiento. 41
Para evaluar la inhibición de la transcripción, se utilizan dos métodos: la electroforesis en gel de agarosa y espectroscopia UV-Vis. Electroforesis en gel de agarosa es un método sencillo y eficaz para la separación, identificación y purificación de 0,5 a fragmentos de ADN y ARN-25 kb. 42 espectroscopía UV-Vis se puede utilizar para determinar la concentración y pureza del ARN. 43
Protocol
Representative Results
Discussion
Este ensayo demuestra que la adición de Ga (tpfc) inhibe la transcripción del ARN comparable al de los complejos de unión al ADN contra el cáncer conocidos actinomicina D y de triptólido. El comportamiento citotóxico de Ga (tpfc) (GI 50 = 58,1 a 154,7 M) puede debido a sus propiedades inhibidoras. Puesto que ninguna inhibición de la transcripción se observó en tpfc, la citotoxicidad de tpfc no es debido a la inhibición de la transcripción de ARN sino que es causada por otros medios aún no estudiad…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos sinceramente al Dr. Cindy N. Chiu ayuda con electroforesis en gel, y Andy Zhou y Michael Grodick por su generosa donación de ADN y enzimas de restricción. Agradecemos el profesor J. Heath y el profesor D. Prober para generoso acceso a equipos y materiales. Agradecemos al Dr. Karn Sorasaenee para sugerencias útiles. Damos las gracias a Mary H. Tang para la creación de la figura utilizada en la visión esquemática en el video. El financiamiento fue proporcionado por Johnson & Johnson y USC Y86786.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Actinomycin D | Sigma-Aldrich | A1410 | Store at 2-8 °C , protect from light |
| Triptolide | Sigma-Aldrich | T3652 | Store at 2-8 °C , protect from light |
| nuclease-free H2O | Life Technologies | AM9938 | |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Life Technologies | AM1334 | Store at –20 °C |
| Ethidium Bromide | Sigma-Aldrich | E7637 | CAUTION: For proper handling procedures of ethidium bromide, please see: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667 |
| Tris Acetate | Sigma-Aldrich | T6025 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | EDS | |
| UltraPure Agarose | Life Technologies | 16500-100 | |
| mini Quick Spin RNA Columns | Roche Life Science | 11814427001 | Store at 2-8 °C , do not freeze |
| 1 kb DNA Ladder | New England Biolabs | N3232S | Store at –20 °C |
References
- Weinstein, I. B. Addiction to oncogenes—The Achilles heel of cancer. Science. 297, 63-64 (2002).
- Derheimer, F. A., Chang, C. W., Ljungman, M. Transcription inhibition: A potential strategy for cancer therapeutics. Eur. J. Cancer. 41 (16), 2569-2576 (2005).
- Koumenis, C., Giaccia, A. Transformed cells require continuous activity of RNA polymerase II to resist oncogene-induced apoptosis. Mol. Cell. Biol. 17 (12), 7306-7316 (1997).
- Stellrecht, C. M., Chen, L. S. Transcription Inhibition as a Therapeutic Target for Cancer. Cancers. 3 (4), 4170-4190 (2011).
- Bensaude, O. Inhibiting eukaryotic transcription: Which compound to choose? How to evaluate its activity. Transcription. 2 (3), 103-108 (2011).
- Liu, Q. Triptolide and its expanding multiple pharmacological functions. International Immunopharmacology. 11 (3), 377-383 (2011).
- Mahammed, A., Gray, H. B., Weaver, J. J., Sorasaenee, K., Gross, Z. Amphiphilic corroles bind tightly to human serum albumin. Bioconjugate Chemistry. 15 (4), 738-746 (2004).
- Lim, P. Differential cytostatic and cytotoxic action of metallocorroles against human cancer cells: Potential platforms for anticancer drug development. Chemical Research in Toxicology. 25 (2), 400-409 (2012).
- Bendix, J., Dmochowski, I. J., Gray, H. B., Mahammed, A., Simkhovich, L., Gross, Z. Structural, electrochemical, and photophysical properties of gallium(III) 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corrole. Angewandte Chemie-International Edition. 39 (22), 4048-4051 (2000).
- Hwang, J. Y., Gross, Z., Gray, H. B., Medina-Kauwe, L. K., Farkas, D. L. Ratiometric spectral imaging for fast tumor detection and chemotherapy monitoring in vivo. Journal of Biomedical Optics. 16 (6), 1-6 (2011).
- Agadjanian, H. Tumor detection and elimination by a targeted gallium corrole. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (15), 6105-6110 (2009).
- Hwang, J. Y. Photoexcitation of tumor-targeted corroles induces singlet oxygen-mediated augmentation of cytotoxicity. Journal of Controlled Release. 163 (3), 368-373 (2012).
- Hwang, J. Y., et al. Investigating photoexcitation-induced mitochondrial damage by chemotherapeutic corroles using multimode optical imaging. Journal of Biomedical Optics. 17 (1), 11 (2012).
- Hwang, J. Y. A Mechanistic Study of Tumor-Targeted Corrole Toxicity. Molecular Pharmaceutics. 8 (6), 2233-2243 (2011).
- Saltsman, I., Mahammed, A., Goldberg, I., Tkachenko, E., Botoshansky, M., Gross, Z. Selective substitution of corroles: Nitration, hydroformylation, and chlorosulfonation. Journal of the American Chemical Society. 124 (25), 7411-7420 (2002).
- Gershman, Z., Goldberg, I., Gross, Z. DNA Binding and Catalytic Properties of Positively Charged Corroles. Angewandte Chemie. 46 (23), 4320-4324 (2007).
- Fu, P. K., Bradley, P. M., Turro, C. Stabilization of duplex DNA structure and suppression of transcription in vitro by bis(quinone diimine) complexes of rhodium(III) and ruthenium(II). Inorganic Chemistry. 42 (3), 878-884 (2003).
- Sorasaenee, K., Fu, P. K. -. L., Angeles-Boza, A. M., Dunbar, K. R., Turro, C. Inhibition of Transcription in Vitro by Anticancer Active Dirhodium(II) Complexes. Inorg. Chem. 42 (4), 1267-1271 (2003).
- Aguirre, J. D., Lutterman, D. A., Angeles-Boza, A. M., Dunbar, K. R., Turro, C. Effect of axial coordination on the electronic structure and biological activity of dirhodium(II,II) complexes. Inorganic Chemistry. 46 (18), 7494-7502 (2007).
- Raja, N. S., Nair, B. U. Chromium(III) complexes inhibit transcription factors binding to DNA and associated gene expression. Toxicology. 251 (1-3), 61-65 (2008).
- Gao, F., Chen, X., Wang, J. Q., Chen, Y., Chao, H., Ji, L. N. In Vitro Transcription Inhibition by Ruthenium(II) Polypyridyl Complexes with Electropositive Ancillary Ligands. Inorganic Chemistry. 48 (13), 5599-5601 (2009).
- Chen, X., Gao, F., Zhou, Z. X., Yang, W. Y., Guo, L. T., Ji, L. N. Effect of ancillary ligands on the topoisomerases II and transcription inhibition activity of polypyridyl ruthenium(II) complexes. Journal of Inorganic Biochemistry. 104 (5), 576-582 (2010).
- Chen, X., Gao, F., Yang, W. Y., Sun, J., Zhou, Z. X., Ji, L. N. Effects of intercalative ligands on the DNA binding, DNA topoisomerase II and DNA transcription inhibition of polypyridyl ruthenium(II) complexes. Inorganica Chimica Acta. 378 (1), 140-147 (2011).
- Chen, X., Gao, F., Yang, W. Y., Zhou, Z. X., Lin, J. Q., Ji, L. N. Structure-activity relationship of polypyridyl ruthenium(II) complexes as DNA intercalators, DNA photocleavage reagents, and DNA topoisomerase and RNA polymerase inhibitors. Chemistry & Biodiveristy. 10 (3), 367-384 (2013).
- Chifotides, H. T., Fu, P. K., Dunbar, K. R., Turro, C. Effect of equatorial ligands of dirhodium(II,II) complexes on the efficiency and mechanism of transcription inhibition in vitro. Inorganic Chemistry. 43 (3), 1175-1183 (2004).
- Pauly, M., Kayser, I., Schmitz, M., Dicato, M., Del Guerzo, A., Kolber, I., Moucheron, C., Kirsch-De Mesmaeker, A. In vitro inhibition of gene transcription by novel photo-activated polyazaaromatic ruthenium(II) complexes. Chemical Communications. 10, 1086-1087 (2002).
- Richardson, D. R. Iron and gallium increase iron uptake from transferring by human melanoma cells: Further examination of the ferric ammonium citrate-activated iron uptake process. Biochimica et Biophysica Acta. 1536 (1), 43-54 (2001).
- Collery, P., Keppler, B., Madoulet, C., Desoize, B. Gallium in cancer treatment. Critical Reviews in Oncology / Hematology. 42 (3), 283-296 (2002).
- Hedley, D. W., Tripp, E. H., Slowiaczek, P., Mann, G. J. Effect of gallium on DNA synthesis by human T-cell lymphoblasts. Cancer Research. 48 (11), 3014-3018 (1988).
- Chitambar, C. R., Narasimhan, J., Guy, J., Sem, D. S., O’Brien, W. J. Inhibition of ribonucleotide reductase by gallium in murine leukemic L1210 cells. Cancer Research. 51, 6199-6201 (1991).
- Seidman, A. D. Continuous infusion gallium nitrate for patients with advanced refractory urothelial tract tumors. Cancer. 68, 2561-2565 (1991).
- Chitambar, C. R. Medical applications and toxicities of gallium compounds. International Journal of Environmental Research and Public Health. 7 (5), 2337-2361 (2010).
- Chitambar, C. R. Gallium-containing anticancer compounds. Future Medicinal Chemistry. 4 (10), 1257-1272 (2012).
- Trask, D. K., Muller, M. T. Stabilization of type I topoisomerase-DNA covalent complexes by actinomycin D. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (5), 1417-1421 (1988).
- Chang, T. C., Tsai, L. C., Hung, M. W., Chu, L. L., Chu, J. T., Chen, Y. C. Effects of transcription and translation inhibitors on a human gastric carcinoma cell line. Potential role of Bcl-X(S) in apoptosis triggered by these inhibitors. Biochemical Pharmacology. 53 (7), 969-977 (1997).
- Mischo, H. E., Hemmerich, P., Grosse, F., Zhang, S. Actinomycin D induces histone gamma-H2AX foci and complex formation of gamma-H2AX with Ku70 and nuclear DNA helicase II. The Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 9586-9594 (2005).
- Titov, D. V. XPB, a subunit of TFIIH, is a target of the natural product triptolide. Nature Chemical Biology. 7 (3), 182-188 (2011).
- Leuenroth, S. J., Crews, C. M. Triptolide-induced transcriptional arrest is associated with changes in nuclear substructure. Cancer Researcg. 68 (13), 5257-5266 (2008).
- Vispé, S. Triptolide is an inhibitor of RNA polymerase I and II-dependent transcription leading predominantly to down-regulation of short-lived mRNA. Molecular Cancer Therapeutics. 8 (10), 2780-2790 (2009).
- . MEGAscript T7 Transcription Kit User Guide. Current Protocols in Molecular Biology. , (2014).
- Fleige, S., Pfaffl, M. W. RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance. Molecular Aspects of Medicine. 27 (2-3), 126-139 (2006).
- . . Quick Spin Columns Protocol. , (2013).
- . . RNA quality control. , (2007).
- Sabris, R. W. . Handbook of biological dyes and stains: synthesis and industrial application. , (2010).
