Um<em> In Vitro</em> Ensaio Enzimático para Medir Inibição da transcrição pelo gálio (III) e H<sub> 3</sub> 5,10,15-tris (pentafluorofenil) corroles
Summary
O gálio (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole e seu análogo freebase apresentam baixa citotoxicidade celular micromolar. Este manuscrito descreve uma reacção de transcrição de ARN, ARN de imagem com um gel corado com brometo de etídio, e quantificar RNA com espectroscopia de UV-Vis, a fim de avaliar a inibição da transcrição por corroles e demonstra um método simples de avaliar as propriedades anti-cancro candidatas.
Abstract
A quimioterapia envolve frequentemente largo espectro de agentes citotóxicos com muitos efeitos secundários e direccionamento limitado. Corroles são uma classe de macrociclos tetrapirrólicos que exibem propriedades citostáticas e citotóxicas diferenciais em linhas de células específicas, dependendo das identidades dos metálico quelado e grupos funcionais. O comportamento única de corroles funcionalizados para linhagens celulares específicas introduz a possibilidade de quimioterapia alvejado.
Muitos medicamentos anti-cancerígenos são avaliados pela sua capacidade para inibir a transcrição do RNA. Aqui apresenta-se um protocolo passo-a-passo para transcrição de ARN na presença de inibidores conhecidos e potenciais. A avaliação dos produtos de ARN da reacção de transcrição por electroforese em gel e espectroscopia de UV-Vis fornece informações sobre as propriedades inibidoras de potenciais candidatos a fármacos anti-cancro e, com modificações para o ensaio, mais sobre o seu mecanismo de acção.
Poucoé conhecido sobre o mecanismo molecular de acção de citotoxicidade corrole. Neste experimento, consideramos dois compostos corrole: gálio (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (Ga (tpfc)) e analógica freebase 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (tpfc). Um ensaio de transcrição do RNA foi usado para examinar as propriedades inibidoras dos corroles. Cinco reacções de transcrição foram preparados: ADN tratado com actinomicina D, triptolido, Ga (tpfc), a uma tpfc [complexo]: [ADN molde de base] razão de 0,01, respectivamente, e um controlo não tratado.
As reacções de transcrição foram analisadas após 4 h utilizando electroforese em gel de agarose e a espectroscopia UV-Vis. Existe um claro inibição por Ga (tpfc), Actinomicina D, e triptolide.
Este ensaio de transcrição de ARN pode ser modificado para proporcionar mais detalhe mecanicista, variando as concentrações do complexo anti-cancro, o ADN, ou uma enzima polimerase, ou por incubação da polimerase do ADN ou com o complexes antes da transcrição de ARN; estas modificações se diferenciar entre um mecanismo envolvendo a inibição do ADN ou a enzima. A adição do complexo após a transcrição do RNA pode ser utilizado para testar se os complexos de degradar ou hidrolisar o RNA. Este ensaio também pode ser usado para estudar candidatos anticancerígenos adicionais.
Introduction
A quimioterapia muitas vezes envolve amplo espectro agentes citotóxicos com efeitos colaterais indesejáveis e segmentação limitado, mas com uma maior compreensão da biologia do câncer, há uma demanda cada vez maior por agentes anticancerígenos com maior eficácia a segmentação câncer e menos efeitos colaterais. 1 células cancerosas humanas tornam-se frequentemente dependente de um único oncogene activado ou super-expresso para a sobrevivência. 2 Assim, muitas drogas anti-cancro são avaliados pela sua capacidade para inibir a transcrição do RNA. Os tratamentos que bloqueiam a expressão destes genes transformantes são eficazes na eliminação de células cancerosas e conduzir à morte celular. 3 As células transformadas são mais sensíveis às perturbações na transcrição de ARN que são células normais correspondentes. 4 fármacos anti-cancro que inibem a transcrição são esperados para inibem selectivamente a expressão de oncogenes que são necessários para a célula cancerosa para sobreviver. 5 Por conseguinte, a transcrição do RNA inhibition é uma maneira útil para identificar potenciais candidatos a medicamentos anticâncer e aprender mais sobre seu mecanismo de ação. Este protocolo demonstra que Ga (tpfc) inibe a transcrição de ARN na mesma ordem que as drogas quimioterápicas actinomicina D e triptólido; Comparações semelhantes podem ser feitas usando este protocolo com outros candidatos a fármacos anticâncer. Actinomicina D é um inibidor da transcrição RNA comumente usado para tratar câncer trofoblástica gestacional, câncer testicular, tumor de Wilms, rhabdomyosacoma, e Ewing do sarcoma 6. Actinomicina D tem sido utilizado em terapia de cancro para cerca de cinquenta anos desde que foi aprovado pela FDA em primeiro lugar em 1964.Triptolide é um inibidor selectivo de transcrição que tem sido investigado in vitro e em diversos modelos animais portadores de tumores de 30 anos. 7
A natureza macrocyclic amphiphilic de corroles confere vantagens significativas sobre outras classes de drogas, tais como moléculas pequenas ou biológicos. 8-14 O carácter macrocíclico permite a permeabilidade celular, que é maior do que o esperado para tais moléculas grandes, e que são suficientemente grandes para interagir com superfícies macromoleculares, tais como os de proteínas. Corroles 8 são conhecidas por formar complexos não covalentes apertadas com biomoléculas e drogas. 10 Além da citotoxicidade inerente do quadro corrole, nós demonstramos que a corrole sulfonados actua como uma molécula veículo para agentes quimioterapêuticos, especialmente a antraciclinas doxorubicina droga intercalante de ADN. Quando o corrole sulfonado foi co-administrado com a doxorrubicina, um aumento de 3 vezes na IC50 de doxorrubicina foi observado para células DU-145. 9 O quadro corrole é estável e tem de absorvância e fluorescência propriedades intrínsecas que, quando funcionalizado, se submetem a mudanças únicas de absorvância que podem ser utilizados para a caracterização. 10 Funcionalização de andaime não inerentemente affect as propriedades fotofísicas da corrole, 9-15, mas, como pode ser visto com um corrole sulfonado, modificando selectivamente a estrutura do corrole pode alterar substancialmente as suas propriedades biológicas. 16 já foi previamente avaliada seis metallocorroles contra sete linhas de células de cancro humano. Os resultados indicam que a toxicidade em relação às células cancerosas humanas é dependente do ião de metal específico, bem como a substituição do grupo funcional. Por exemplo, de gálio corroles sulfonados experimentado alta absorção celular e penetrou selectivamente para dentro do núcleo de células cerebrais de cancro da próstata metastizado (DU-145); células da mesma corrole, embora não penetre no núcleo de outras linhas de células, apresenta uma maior citotoxicidade da mama (MDA-MB-231), melanoma (SK-MEL-28), e do ovário (OVCAR-3) do cancro do que para cancro da próstata. 9
Os ensaios baseados em células iniciais indicam que estes compostos são promissores como agentes terapêuticos anti-cancro, que merece Further investigação sobre o mecanismo de acção. Inibição da transcrição é observado com certos complexos organometálicos 17-27 e procurou-se examinar este processo como um mecanismo possível para o comportamento citotóxico da família corrole. Este ensaio de transcrição proporciona um método simples, de baixo custo, e fácil para avaliar a inibição de transcrição, o que irá conduzir a uma informação mais detalhada acerca dos efeitos destas moléculas em células vivas.
Aqui, a inibição da transcrição de gálio (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (Ga (tpfc)) e o seu análogo de base livre 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (tpfc) (Figura 1) são testados. Ao contrário de alguns complexos de metais de transição, gálio (III) é inactiva redox e, por conseguinte, não está directamente envolvido no processo redox de vias metabólicas à base de redox. 28 Independentemente, gálio (III) que apresentam propriedades citotóxicas e tem sido investigada para fins terapêuticos. Gálio é o segundo metal mais promissora para terapias anticâncer após platina e foi submetido a muitos estudos e investigações; sais de nitrato e cloreto de gálio foram avaliadas em ensaios clínicos contra hepatoma, linfomas, cânceres de bexiga, e outras doenças. 29-34 gálio (III) é, portanto, ideal para anticancerígenos estudos corrole. Os dados iniciais mostram Ga (tpfc) e tpfc têm baixa GI 50, a concentração de droga necessária para inibir 50% da proliferação celular máxima, com várias linhas celulares de cancro (ver Figura 2); este afirma a validade de novas experiências com estes dois compostos para determinar suas propriedades inibidoras. Nós comparar estes compostos com as drogas anticâncer comum Actinomicina D e triptólido. Actinomicina D intercala ADN, ARN inibe o alongamento, e induz a apoptose em certa linha de células em concentrações picomolares 6,35-37 Triptólido tem mostrado inibir o crescimento do tumor.; liga-se a XPB humano / ERCC3, uma subunidade ofactor de transcrição f TFIIH, levando à inibição da actividade de ARN-polimerase II. 6-7,38-40
Enquanto é vulgarmente conhecido que corroles apresentam propriedades citotóxicas, existe pouca informação sobre os diferentes mecanismos decorrentes de funcionalização. Inibição Corrole de RNA transcrição iria oferecer um maior conhecimento sobre suas interações com biomacromoléculas. Outros complexos conhecidos por se ligarem ao ADN, tais como dirhodium (II, II), complexos de crómio (III), complexos, de ruténio (II) polypyridyl, ródio (III), complexos, e vários outros, foram submetidas a ensaios de transcrição de ARN, 18- 27 resultando em uma maior compreensão de suas interações com biomacromoléculas. Esta experiência fácil e amplamente disponível é também um bom teste inicial para avaliar as propriedades de citotoxicidade de uma dada molécula e determinar se deveria ser mais testes biológicos. O ensaio também permite a transcrição do RNA para várias modificações, tais como varying, a quantidade de composto ou enzimas utilizada; variando o período de incubação, tempo de reacção e pontos de tempo de amostragem; e variando-se o comprimento e a sequência de DNA molde, entre outras variáveis de interesse, assim, potencialmente oferecendo uma grande quantidade de dados. Este ensaio de transcrição também está prontamente disponível como kits preços acessíveis, com todos os componentes necessários, desde reação, embora os componentes podem ser comprados e preparados individualmente. Nestas experiências, podemos usar um kit disponível comercialmente conhecido por ter um rendimento elevado 41.
Para avaliar a inibição da transcrição, usamos dois métodos: eletroforese em gel de agarose e espectroscopia UV-Vis. Electroforese em gel de agarose é um método simples e eficaz para a separação, identificação e purificação de 0,5 a fragmentos de ADN e ARN de 25 kb. 42 espectroscopia UV-Vis pode ser utilizado para determinar a concentração e pureza do ARN. 43
Protocol
Representative Results
Discussion
Este ensaio demonstra que a adição de Ga (tpfc) inibe a transcrição de ARN comparavelmente aos complexos anticancro de ligação de ADN conhecidos actinomicina D e triptólido. O comportamento citotóxico de Ga (tpfc) (GI = 50 58,1-154,7 M) pode, devido às suas propriedades inibidoras. Uma vez que não foi observada inibição da transcrição em tpfc, a citotoxicidade de tpfc não é devido a inibição da transcrição de ARN, mas é causada por outros meios, ainda não estudadas.
<p class="jove_co…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos sinceramente Dr. Cindy N. Chiu para obter ajuda com eletroforese em gel, e Andy Zhou e Michael Grodick por sua generosa doação de DNA e enzimas de restrição. Agradecemos Professor J. Heath e Professor D. Prober para acesso generoso para equipamentos e materiais. Agradecemos ao Dr. Karn Sorasaenee para sugestões úteis. Agradecemos Mary H. Tang para a criação da ilustração usada no panorama de conjunto no vídeo. O financiamento foi fornecido pela Johnson & Johnson e USC Y86786.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Actinomycin D | Sigma-Aldrich | A1410 | Store at 2-8 °C , protect from light |
| Triptolide | Sigma-Aldrich | T3652 | Store at 2-8 °C , protect from light |
| nuclease-free H2O | Life Technologies | AM9938 | |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Life Technologies | AM1334 | Store at –20 °C |
| Ethidium Bromide | Sigma-Aldrich | E7637 | CAUTION: For proper handling procedures of ethidium bromide, please see: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667 |
| Tris Acetate | Sigma-Aldrich | T6025 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | EDS | |
| UltraPure Agarose | Life Technologies | 16500-100 | |
| mini Quick Spin RNA Columns | Roche Life Science | 11814427001 | Store at 2-8 °C , do not freeze |
| 1 kb DNA Ladder | New England Biolabs | N3232S | Store at –20 °C |
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