En<em> In Vitro</em> Enzymatisk analys för att mäta transkription Hämning av gallium (III) och H₃ 5,10,15-tris (pentafluorfenyl) corroles

Summary

Gallium (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole och dess freebase analog uppvisar låg mikromolära cellcytotoxicitet. Detta manuskript beskriver en RNA-transkription reaktion, imaging-RNA med en etidiumbromid-färgade gelén, och kvantifiera RNA med UV-Vis-spektroskopi, för att bedöma transkription hämning av corroles och visar en enkel metod för att utvärdera cancer kandidat egenskaper.

Abstract

Cytostatika innebär ofta bredspektrum cytotoxiska medel med många biverkningar och begränsad inriktning. Corroles är en klass av tetrapyrrolic makrocykler som uppvisar differential cytostatiska och cytotoxiska egenskaper i specifika cellinjer, beroende på identiteten på kelaterade metallen och funktionella grupper. Den unika beteende funktion corroles mot specifika cellinjer införs möjligheten riktade kemoterapi.

Många anticancerläkemedel utvärderas genom deras förmåga att inhibera RNA-transkription. Här presenterar vi en steg-för-steg-protokoll för RNA-transkription i närvaro av kända och potentiella inhibitorer. Utvärderingen av RNA produkter av transkriptionsreaktionen med gelelektrofores och UV-Vis-spektroskopi ger information om hämmande egenskaper hos potentiella anticancer läkemedelskandidater och med ändringar i analysen, mer om deras verkningsmekanism.

Litenär känt om den molekylära verkningsmekanismen för corrole cytotoxicitet. I detta experiment, anser vi två corrole föreningar: gallium (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (Ga (tpfc)) och fri bas analog 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (tpfc). En RNA-transkription analys användes för att undersöka de inhiberande egenskaperna hos corroles. Fem transkriptionsreaktioner framställdes: DNA behandlades med aktinomycin D, triptolid, Ga (tpfc), tpfc vid en [komplex]: [mall-DNA bas] förhållande av 0,01, respektive, och en obehandlad kontroll.

De transkriptionsreaktioner analyserades efter 4 h med användning av agarosgelelektrofores och UV-Vis-spektroskopi. Det finns tydliga inhibition av Ga (tpfc), Actinomycin D, och triptolid.

Detta RNA transkriptionsanalys kan modifieras för att ge mer mekanistisk detalj genom att variera koncentrationerna av anticancer-komplex, DNA eller polymerasenzym, eller genom att inkubera DNA eller polymeras med kompletxes före RNA-transkription; dessa ändringar skulle skilja mellan en hämning mekanism som involverar DNA eller enzymet. Lägga komplexet efter RNA-transkription kan användas för att testa om komplexen försämra eller hydrolysera RNA. Denna analys kan också användas för att studera ytterligare anticancer kandidater.

Introduction

Cytostatika innebär ofta bredspektrum cytotoxiska medel med oönskade biverkningar och begränsad inriktning, men med större förståelse för cancerbiologi, det finns en ständigt ökande efterfrågan på anticancermedel med högre cancermåls effekt och färre biverkningar. ¹ Mänskliga cancerceller blir ofta beroende av en enda aktiverad eller överuttryckt onkogen för överlevnad. ² Således är många anticancerläkemedel utvärderades genom deras förmåga att inhibera RNA-transkription. Behandlingar som blockerar uttrycket av dessa transformerande gener är effektiva i att eliminera cancerceller och leder till celldöd. ³ Transformerade celler är mer känsliga för störningar i RNA-transkription än är motsvarande normala celler. ⁴ Anticancer läkemedel som hämmar transkription förväntas selektivt hämmar expression av onkogener som är nödvändiga för cancercellen för att överleva. ⁵ Följaktligen RNA-transkription inhibition är ett bra sätt att identifiera potentiella cancerläkemedel läkemedelskandidater och lära sig mer om deras verkningsmekanism. Detta protokoll visar att Ga (tpfc) hämmar RNA-transkription på samma ordning som de cytostatika Actinomycin D och triptolid; liknande jämförelser kan göras med hjälp av detta protokoll med andra cancer läkemedelskandidater. Aktinomycin D är en RNA-transkriptionshämmare som vanligen används för att behandla graviditets trofoblastisk cancer, testikelcancer, Wilms tumör, rhabdomyosacoma och Ewings sarkom ^6. Actinomycin D har använts inom cancerterapi för nästan femtio år sedan den första godkända av FDA i 1964.Triptolide är en selektiv transkriptionshämmare som har undersökts in vitro och i olika tumörbärande djurmodeller för 30 år. ⁷

Den amfifila makrocykliska natur corroles ger betydande fördelar jämfört med andra läkemedelsklasser såsom små molekyler eller biologiskas. ^8-14 Den makrocykliska karaktär möjliggör cellulär permeabilitet som är större än förväntat för sådana stora molekyler, och de är tillräckligt stora för att interagera med makromolekylära ytor, såsom de av proteiner. ⁸ Corroles är kända för att bilda täta icke-kovalenta komplex med biomolekyler och droger. ¹⁰ Förutom den inneboende cytotoxicitet av corrole ram, har vi visat att en sulfonerad corrole fungerar som en bärarmolekyl för kemoterapeutiska medel, specifikt DNA-interkalerande antracyklin drogen doxorubicin. När sulfonerade corrole administrerades tillsammans med doxorubicin, var en 3-faldig förbättring i IC ₅₀ av doxorubicin observerats för DU-145-celler. ⁹ corrole ram är stabil och har inneboende absorbans och fluorescens egenskaper som, när de funktion, genomgår unika absorbans skift som kan användas för karakterisering. ¹⁰ Funktionalisering av den byggnadsställning inte inneboende affect de fotofysikaliska egenskaperna hos corrole, ^9-15, men, sett med en sulfonerad corrole, selektivt modifiera ramen för corrole kan väsentligt ändra dess biologiska egenskaper. ¹⁶ Vi har tidigare utvärderat sex metallocorroles mot sju humana cancercellinjer. Resultaten tyder på att toxicitet mot humana cancerceller är beroende av den specifika metalljoner, liksom funktionell grupp-substitution. Till exempel, sulfonerade gallium corroles upplevt hög cellulärt upptag och trängde selektivt in i kärnan av hjärnmetastaserprostatacancerceller (DU-145); samma corrole, även om det inte tränger in i kärnan hos andra cellinjer, uppvisar större cytotoxicitet för bröst (MDA-MB-231), melanom (SK-MEL-28), och äggstocks (OVCAR-3) cancerceller än för prostatacancer. ⁹

Initiala cellbaserade analyser indikerar att dessa föreningar visar lovande som anticancer terapeutiska medel, vilka meriter further undersökning av verkningsmekanism. Transkription hämning med vissa metallorganiska komplex ^17-27 och vi försökte undersöka denna process som en möjlig mekanism för den cytotoxiska beteende corrole familjen. Denna transkriptionsanalys ger en enkel, billig och enkel metod för att bedöma transkription inhibition, vilket kommer att leda till mer detaljerad information om effekterna av dessa molekyler i levande celler.

Här, transkriptionen hämning av gallium (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (Ga (tpfc)) och dess freebase analog 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (tpfc) (Figur 1) testas. Till skillnad från vissa övergångsmetallkomplex, (III) är gallium redox inaktiv och därför inte är direkt involverad i redox process redox-baserade metabola vägar. ²⁸ Oavsett, gallium (III) inte uppvisar cytotoxiska egenskaper och har undersökts i terapeutiska syften. Gallium är den näst mest lovande metall för cancer läkemedel efter platina och har genomgått många studier och undersökningar; nitrat och klorid gallium alter har utvärderats i kliniska prövningar mot hepatom, lymfom, blåscancer, och andra sjukdomar. ^29-34 Gallium (III) är därför idealisk för cancer corrole studier. Initiala data visar Ga (tpfc) och tpfc har lågt GI _50, den koncentration som är nödvändig läkemedlet för att hämma 50% av maximal cellproliferation, med olika cancercellinjer (se figur 2); Detta bekräftar giltigheten av ytterligare experiment på dessa två föreningar för att bestämma deras hämmande egenskaper. Vi jämför dessa föreningar med vanliga cytostatika Actinomycin D och triptolid. Actinomycin D interkalerar DNA, hämmar RNA töjning, och inducerar apoptos i vissa cellinje vid pikomolar koncentrationer ^6,35-37 Triptolid har visats hämma tumörtillväxt. det binder till humant XPB / ERCC3, en subenhet of transkriptionsfaktor TFIIH, vilket leder till hämning av RNA-polymeras II aktivitet. ^6-7,38-40

Även om det är allmänt känt att corroles uppvisar cytotoxiska egenskaper, det finns lite information om de olika mekanismer som följer av funktion. Corrole hämning av RNA-transkription skulle erbjuda större insikt om deras interaktioner med biomakromolekyler. Andra komplex kända för att binda till DNA, såsom dirhodium (II, II) -komplex, krom (III) -komplex, rutenium (II) polypyridyl komplex, rodium (III) komplex, och diverse andra, utsattes för RNA-transkriptionsanalyser, ^{18- 27} vilket resulterar i större förståelse för deras interaktioner med biomakromolekyler. Denna lättköpt och allmänt tillgängliga experiment är också ett bra första test för att bedöma cytotoxicitet egenskaperna hos en given molekyl och avgöra om den förtjänar ytterligare biologisk testning. Den RNA-transkription analysen möjliggör även för många modifieringar, såsom varying mängden av föreningen eller enzymer som används; att variera inkubationstiden, reaktionstid och prov tidpunkter; och varierande DNA-mallen längd och sekvens, bland andra variabler av intresse, således potentiellt ge en stor mängd data. Denna transkriptions analys är också lätt tillgänglig som prisvärda kit med alla nödvändiga reaktionskomponenter som, även om komponenterna kan köpas och förberett sig. I dessa experiment använder vi en kommersiellt tillgänglig kit kända för att ha hög avkastning. ⁴¹

För att bedöma transkription inhibition, använder vi två metoder: agarosgelelektrofores och UV-Vis spektroskopi. Agarosgelelektrofores är en enkel och effektiv metod för separering, identifiering och rening av 0,5- till 25-kb DNA och RNA-fragment. ⁴² UV-Vis-spektroskopi kan användas för att bestämma koncentrationen och renheten hos RNA. ⁴³

Protocol

OBS: När du arbetar med RNA upprätthålla en ren arbetsmiljö för att undvika föroreningar av DNas och RNas enzymer som bryter ner DNA och RNA. Se till att pipettspetsarna och rör är DNas och RNas gratis. Det är också bra att torka av labbytor och utrustning såsom pipetter, hållare röret, etc. med en saneringslösning. 1. RNA Transkription med Corrole Behandling Förbered corrole och hämmarföreningar i en 0,01: 1 molförhållande av [komplex]: [DNA]. OBS: I vå…

Representative Results

RNA-transkription kvalitativt genom agarosgelelektrofores Agarosgelelektrofores används för att avbilda den transkriberade RNA. Etidiumbromid fluorescerar vid bindning (λ em = 605 nm, λ ex = 210 nm, 285 nm) 46 möjliggör avbildning av RNA. Mörkare banden i gelén motsvarar högre koncentrationer av RNA. Om Aktinomycin D, hämmar triptolid, eller antingen corrole komplex RNA-transkription, är produktionen av RNA minskade och bandet komm…

Discussion

Denna analys visar att tillsatsen av Ga (tpfc) inhiberar RNA-transkription jämförbar med de kända DNA-bindande anticancerkomplex aktinomycin D och triptolid. Den cytotoxiska beteende Ga (tpfc) (GI ₅₀ = 58,1 till 154,7 M) kan på grund av sin hämmande egenskaper. Eftersom ingen transkriptions inhibering observerades i tpfc, inte beror på RNA-transkription hämning cytotoxiciteten av tpfc utan orsakas av andra medel som ännu inte studerats.

I de fyra transkriptionsreaktioner u…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Actinomycin D	Sigma-Aldrich	A1410	Store at 2-8 °C , protect from light
Triptolide	Sigma-Aldrich	T3652	Store at 2-8 °C , protect from light
nuclease-free H2O	Life Technologies	AM9938
MEGAscript T7 Transcription Kit	Life Technologies	AM1334	Store at –20 °C
Ethidium Bromide	Sigma-Aldrich	E7637	CAUTION: For proper handling procedures of ethidium bromide, please see: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667
Tris Acetate	Sigma-Aldrich	T6025
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	EDS
UltraPure Agarose	Life Technologies	16500-100
mini Quick Spin RNA Columns	Roche Life Science	11814427001	Store at 2-8 °C , do not freeze
1 kb DNA Ladder	New England Biolabs	N3232S	Store at –20 °C