Der Nachweis von exosomalen Biomarker von Electric Field-induzierte Freisetzung und Messung (Efirm)
Summary
Exosomes are microvesicular structures found within biofluids that potentially carry important disease discriminatory biomarkers. Here, a novel method is used to specifically extract exosomes and rapidly test the exosomal cargo for both RNA/protein targets following the disruption of exosomes using non-uniform electric cyclic square waves.
Abstract
Exosomen sind mikrovesikulären Strukturen, die eine Vermittlerrolle in der interzellulären Kommunikation spielen. Es ist von Interesse, um die innere Ladung von Exosomen studieren, um festzustellen, ob sie Krankheit diskriminierenden Biomarker tragen. Zur Durchführung exosomalen Analyse ist es notwendig, ein Verfahren zur Extraktion und Analyse von Exosomen Ziel biofluids ohne Beschädigung der internen Inhalte zu entwickeln.
Elektrisches Feld-induzierte Freisetzung und Messung (Efirm) ist ein Verfahren zur spezifischen extra Exosomen aus biologischen Flüssigkeiten, Entladen ihre Ladung, und testen ihre internen RNA / Proteingehalt. Verwendung eines anti-human CD63 spezifische Antikörper magnetische Mikroteilchen werden Exosomen zuerst aus Biofluiden fällt. Nach der Extraktion, Niederspannungs-Elektro zyklischen Rechtecksignale (CSW) angewendet, um die Vesikelmembran stören und Fracht entladen. Der Inhalt der Exosom, mit DNA-Primer oder Antikörper auf einer Elektrodenoberfläche für qua immobilisierten hybridisiertenntification molekularer Inhalte.
Die Efirm Methode ist für die Extraktion von Exosomen und Entladen von Fracht zur Analyse ohne Lysepuffer vorteilhaft. Dieses Verfahren ist in der Lage, die spezifische Detektion von beiden RNA und Protein Biomarker Ziele in der Exosomen. Efirm extrahiert Exosomen speziell auf ihre Oberflächenmarker basiert im Gegensatz zur Größe basierte Techniken.
Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) und Assay zeigen die Funktionalität des Verfahrens für die Exosom Erfassung und Analyse. Die Efirm Methode wurde die Analyse von 9 Mäusen mit menschlichen Lungenkrebs H640-Zellen injiziert (eine Zelllinie transfiziert, um die Exosom Marker menschlichen CD63-GFP exprimieren) um ihre exosome Profil gegen 11 Mäusen, die Kochsalzlösungskontrollen getestet exosomalen. Erhöhte exosomalen Biomarker (Referenz-Gen GAPDH und Proteinoberflächenmarker CD63 Menschen-GFP) gefunden für das H640 injizierten Mäusen in beiden Serum und Speichelproben. Außerdem saliva und Serumproben wurde gezeigt, dass die Linearität (R = 0,79) haben. Diese Ergebnisse lassen auf die Lebensfähigkeit der Speichel exosome Biomarker zum Nachweis von distalen Krankheiten.
Introduction
Exosom Forschung ist ein aufstrebendes Gebiet der Untersuchung, die Lipid-Mikrobläschen, die RNA-1, 2-DNA und Protein 3 Fracht transportieren sucht. Frühere Untersuchungen von Exosom Biologie haben, um die Identifizierung von Exosomen in Körperflüssigkeiten wie Blut 4, 5 Urin, Muttermilch 6, und Speichel 7 geführt. Studien haben gezeigt, dass Exosomen spielen eine Rolle bei verschiedenen zellulären Wege, fernmedi Kommunikation zwischen verschiedenen Systemen des Körpers 8. Aufgrund der Rolle in Exosomen der interzellulären Kommunikation spielt, wird die Hypothese aufgestellt, dass sie Biomolekül Targets (Protein, RNA und DNA) mit Krankheitszuständen korreliert verpacken. In vitro 3 und Tiermodellstudien 9 angezeigt, um diese Hypothese zu bestätigen. Bei der Untersuchung exosomalen Inhalte für die Entdeckung neuer Biomarker, ist es notwendig, eine Methode für die selektive Exosom Isolation von Körperflüssigkeiten zu entwickeln, induzierte expulsiauf der Ladung von Exosomen und Quantifizierung von Exosom Biomolekülen. In dem Umfang der vorliegenden Arbeit wird Exosomen als eine Struktur mit einem Durchmesser von ca. 70-100 nm und besitzen Oberflächenmarker CD63 definiert werden.
Forscher in der Regel zunächst zu reinigen Exosomen durch Ultrazentrifugation 10 und dann exosomalen Inhalte durch den Einsatz von Lysepuffer Sätze zu verarbeiten. Usage Lysepuffer Verfahren erfordert Inkubationszeiten reichen von Minuten bis Stunden. Dieser Vorgang kann möglicherweise Schaden zufügen Exosom Ladung und führen zu einer Verschlechterung zu probieren. B. Speichel exosome RNA über Lysepuffer in die umgebende extrazelluläre Umgebung freigesetzt besitzt eine Halbwertszeit von weniger als 1 min, wodurch Messung exosomalen RNA post Lysepuffer eine besonders schwierige Aufgabe, ohne den Zusatz von Stabilisierungsreagenzien 11. Das compoundierte Wirkung der Zugabe verschiedener Reagenzien zur Lyse und Stabilisierung können Mittel, die erschweren einzuführen und stören die analysis von exosomalen Inhalt. Eine alternative Vorgehensweise kann hilfreich für die schnelle Entladung exosomalen Inhalt und sicher die Erhaltung der Ladung zur Charakterisierung sein.
In dieser Arbeit schlagen wir die Verwendung eines nicht-gleichmäßiges elektrisches Feld für die Freigabe exosomalen Inhalt. Elektrofelder bekannt, um die Fähigkeit zu polarisieren und stören die Lipid-Doppelschicht, die Zellmembranen bildet durchzuführen. Unsere experimentelle Arbeit untersucht Nutzung ungleichmäßige zyklischen Rechtecksignale (CSW) zur Unterbrechung der microvesicle Struktur der Exosomen und Freigabe geführt Fracht. Bei dieser Methode werden Spannungen in der mehrere hundert Millivolt-Bereich, was bedeutet, dass die meisten Biomoleküle nicht gestört werden. Wir zeigen, dass die Verwendung einer zyklischen Rechteckwellen in der Lage ist, um die Freisetzung von Speichel exosome mRNA-Gehalt in das umgebende Fluidumgebung zu betätigen. Diese Version von exosomalen Inhalt ist nahtlos mit einem Elektrodensystem, die verwendet werden können, um die Biomarker-Expressionsniveaus zu quantifizieren integriert 12,13. Dieses vorgeschlagene Verfahren ermöglicht eine schnelle, empfindliche und Lysepuffer kostenlose Analyse Exosom Inhalt.
Abbildung 1. Übersicht über Efirm-Workflow.. Die Efirm Verfahren wird im Großen und Ganzen in die drei Hauptphasen, die zur Reinigung und Analyse von Exosomen notwendig sind geteilt.
Das CSW auf Basis exosomalen Content-Release und Analyseverfahren wird in Verbindung mit CD63-spezifischen magnetischen Mikrokügelchen für Exosom Isolierung verwendet. Diese CD63-Affinität Perlen ermöglichen die selektive Isolierung von Exosomen aus Speichelproben (und andere Körperflüssigkeiten). Nach der Inkubation und Gewinnung von Exosomen mit den magnetisierten Kügelchen werden die Perlen mit dem elektrochemischen Sensor-System für die CSW basierte Content-Release und Analyse Teil des Experiments migriert. Abbildung 1 gibt einen Überblick über die Arbeitfließt der Efirm Verfahren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wie die Ergebnisse zeigen, sind anti-human CD63-beschichteten magnetischen Nanopartikel in der Lage, spezifisch einzufangen kleine Partikel, die eine Größe im Bereich von 70 bis 100 nm haben. Diese erfassten Teilchens entspricht der zuvor beobachteten Profil Exosomen. Weiterhin ist die Verwendung von Niederspannungs CSW nach der Abscheidung der Teilchen dargestellt, um sie von der Perlenoberfläche zu entfernen und verursachen DNA Abbauprofile ähnlich zu derjenigen eines herkömmlichen Lysepuffer basiertes Verfahren …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der National Center for Research Resources und der National Center for Advancing Translational Sciences, National Institutes of Health, durch Zuschuss UL1TR000124 (FW) unterstützt; die Felix & Mildred Yip Stiftungsprofessur und die Barnes Familie Fonds (zu DTWW), dem National Institute of Dental und kraniofaziale Forschung der National Institutes of Health unter Preis Anzahl T90DE022734 (MT). Der Inhalt ist allein in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Helios 16-Channel Reader System with Chip Interface | Genefluidics, USA | RS-1000-16 | |
| 16X Sensor Chip, Bare Gold, pack of 5 chips | Genefluidics, USA | SC1000-16X-B | |
| Biotinylated anti-human CD63 Antibody | Ancell, USA | 215-030 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Invitrogen, USA | 65601 | |
| Neodynium Magnetics ( 1/10" dia. x 1/32" thick) | K&J Magnetics, USA | DH101 | |
| Ultrapure Distilled Water | Life Technologies, USA | 10977-023 | |
| Mettler Toldeo 3M KcL Solution | Fisher Scientific, USA | 1911512 | |
| Pyrrole | Sigma-Aldrich, USA | W338605-100g | |
| Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments | Roche, Germany | 11426346910 | |
| 3, 3′, 5, 5′ tetramethylbenzidine substrate (TMB/H2O2, low activity) | Neogen, Usa | 330175 | |
| Phosphate Buffered Saline Solution | Life Technologies, USA | 10010023 | |
| Casein/PBS | Fisher Scientific, USA | 37532 |
References
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