通过电场诱导释放和测量（EFIRM）检测外体生物标志物

Summary

Exosomes are microvesicular structures found within biofluids that potentially carry important disease discriminatory biomarkers. Here, a novel method is used to specifically extract exosomes and rapidly test the exosomal cargo for both RNA/protein targets following the disruption of exosomes using non-uniform electric cyclic square waves.

Abstract

外来体是起到间通讯中介的作用，小泡结构。这是研究的外来体的内部货物以确定它们是否携带疾病的生物标志物的歧视性的兴趣。用于执行外来体分析，有必要开发用于提取和分析来自靶生物流体的外来体，而不会损坏内部内容的方法。

电场诱导释放，并测量（EFIRM）是用于具体提取外来体从生物流体，卸载他们的货物，并测试其内部的RNA /蛋白质含量的方法。使用抗人类CD63特定抗体的磁性微粒，外来体被首先从生物流体中沉淀。以下提取，低压电环状方波（CSW）被施加到破坏泡囊膜而引起的货物装卸。外来体的含量杂交固定在电极表面，用于QUA的DNA引物或抗体的ntification分子内容。

该EFIRM方法是有利的提取外来体和卸载货物中的分析，而无需裂解缓冲液。该方法是能够执行RNA和蛋白质生物标志物的目标的特异性检测，在外来体中。 EFIRM提取具体地说明在其表面上的标记的外来体，而不是基于大小的技术。

透射电子显微镜（TEM）和测定表明该方法对于外来体捕获和分析的功能。该EFIRM方法用于外来体注射人肺癌细胞H640 9小鼠的分析，以测试它们的外来体信息对11只小鼠接受盐水对照（转染以表达外来体标记人类CD63-GFP的细胞系）。外体生物标志物水平升高（参照基因GAPDH和蛋白质表面标志CD63人-GFP）被发现的H640小鼠注射血清和唾液样本。此外，贝VA和血清样品证明具有线性关系（r = 0.79）。这些结果暗示对唾液外来体的生物标志物用于检测远端疾病的可行性。

Introduction

切体研究是调查的一个新兴领域，它检查携带RNA ^{1，DNA 2}和³的蛋白脂类货物微泡。以前的调查外来体生物学已经导致鉴定外来体的生物流体诸如血液^4，尿^5，母乳⁶和唾液^7。研究表明，外来体发挥不同细胞途径的作用，远程沉思的体⁸的不同系统之间的通信。的作用，因为外来体在细胞间通讯玩，假定它们可以打包与疾病状态相关的生物分子靶（蛋白质，RNA和DNA）。 体外 ³和动物模型⁹的研究显示为证实这一假设。在调查的生物标志物发现外来体的内容，有必要制定从生物液体选择性切体隔离的方法，诱导expulsi货物从外来体，和切体生物分子​​的定量。在这项工作中的程度，外来体将被定义为具有直径为约70-100纳米，具有表面标记CD63的结构。

研究人员通常先净化外来体由超速^10，然后经过加工裂解液袋使用外体内容。裂解缓冲液的方法的使用需要的孵育时间范围从数分钟到数小时。这个过程可能会潜在危害的外来体货，导致样品降解。例如，通过裂解缓冲液释放到周围的细胞外环境唾液外来体RNA具有的半衰期小于1分钟，使得外来体RNA后裂解的测定缓冲一个特别困难的任务不添加稳定化试剂^11。添加各种试剂溶解和稳定的配合作用可以引入该复杂化剂和干扰ANALYSIS的外来体内容。另一种做法可以是用于快速卸外来体内容并安全地保存货物为表征很有帮助。

在这项工作中，我们提出了一个非均匀电场的用法的外来体内容的释放。电场已被公知的携带极化和破坏形成细胞膜脂双层的能力。我们的实验工作探索不均匀环状方波（CSW）的用法用于破坏外来体的微泡结构和​​释放运载的货物。这种方法在几百毫伏范围内使用电压，这意味着大多数生物分子不会中断。我们表明，环状方波的使用能够致动的唾液mRNA的外来体内容释放进入周围环境中的流体。此释放的外来体内容无缝地与可用于量化生物标志物表达水平的电极系统集成^12,13，该提出的方法允许快速，灵敏，和裂解缓冲液不含外来体含量分析。

图EFIRM工作流1.概述^。该EFIRM方法大致分为三个主要阶段所必需的纯化和分析外来体。

这个CSW基于外来体内容释放和分析方法被用在与CD63的特异性磁微珠为外来体隔离结合使用。这些CD63亲和力磁珠允许从唾液样品（和其他生物流体）的外来体的选择性分离。在温育和提取使用磁化珠的外来体，珠粒被迁移到的CSW基于内容发布和实验分析部的电化学传感器系统。 图1给出了工作的概述流动EFIRM方法。

Protocol

1.基于磁珠的外来体提取吸管5微升链霉亲和涂层的磁性体微粒的充分混合的溶液加入495微升磷酸盐缓冲盐水（PBS）缓冲液中离心管，以重悬珠子。用磁力架洗，重悬珠用500μlPBS中的3倍。机架是磁体上的壳体单元，可容纳的样品的离心管的侧阵列。 对于每一个洗，先让管子坐在架1分钟，然后用枪头小心地取出上清缓存，而不会干扰珠。 放置在常规机架管子而不磁铁在侧。添?…

Representative Results

珠用TEM的外来体捕获验证 以下通过使用透射电子显微镜（TEM）图像提取协议使用抗人类CD63磁性珠从唾液外来体的分离进行了验证。 TEM显示磁珠与70-100纳米颗粒直接相邻（ 见图3A和3B），与外来体的已知轮廓相一致。观察为磁珠唾液那些没有缀合到它们的抗人CD63抗体先前（ 见图3C和3D）无70-100纳米颗粒。 <p cla…

Discussion

其结果表明，抗 – 人CD63包被的磁性纳米颗粒能够特异性捕获具有的尺寸范围为70-100纳米的小颗粒。这个捕获粒子是与外来体的先前观察到的轮廓相一致。此外，低电压的CSW以下，颗粒的捕获的使用被示为从胎圈表面除去它们，并导致DNA降解型材类似于传统的裂解缓冲液基础的方法对货物的释放。此数据表明，外来体货物释放的工作流可以通过一个环状的方波的外来体的脂质膜的破坏的应用被简化…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Helios 16-Channel Reader System with Chip Interface	Genefluidics, USA	RS-1000-16
16X Sensor Chip, Bare Gold, pack of 5 chips	Genefluidics, USA	SC1000-16X-B
Biotinylated anti-human CD63 Antibody	Ancell, USA	215-030
Dynabeads MyOne Streptavidin T1	Invitrogen, USA	65601
Neodynium Magnetics ( 1/10" dia. x 1/32" thick)	K&J Magnetics, USA	DH101
Ultrapure Distilled Water	Life Technologies, USA	10977-023
Mettler Toldeo 3M KcL Solution	Fisher Scientific, USA	1911512
Pyrrole	Sigma-Aldrich, USA	W338605-100g
Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments	Roche, Germany	11426346910
3, 3′, 5, 5′ tetramethylbenzidine substrate (TMB/H2O2, low activity)	Neogen, Usa	330175
Phosphate Buffered Saline Solution	Life Technologies, USA	10010023
Casein/PBS	Fisher Scientific, USA	37532