Rilevazione di Exosomal Biomarker da campo elettrico indotto rilascio e di misura (Efirm)

Summary

Exosomes are microvesicular structures found within biofluids that potentially carry important disease discriminatory biomarkers. Here, a novel method is used to specifically extract exosomes and rapidly test the exosomal cargo for both RNA/protein targets following the disruption of exosomes using non-uniform electric cyclic square waves.

Abstract

Esosomi sono strutture microvescicolare che svolgono un ruolo di mediazione nella comunicazione intercellulare. È interessante studiare il carico interno di esosomi per determinare se trasportano malattie biomarcatori discriminatori. Per l'esecuzione di analisi exosomal, è necessario sviluppare un metodo per l'estrazione e l'analisi exosomes da biofluidi bersaglio senza danneggiare il contenuto interno.

Rilascio elettrico campo indotto e misura (Efirm) è un metodo per estrarre specificamente esosomi da biofluidi, scaricando il loro carico, e testare il loro contenuto di RNA / proteine ​​interna. L'utilizzo di un CD63 specifici anticorpi microparticelle magnetico anti-umano, esosomi vengono prima precipitati da fluidi biologici. Dopo l'estrazione, a bassa tensione onde elettriche quadre ciclici (CSW) vengono applicati per distruggere la membrana vescicolare e causare carico scarico. Il contenuto del exosome viene ibridato al primer DNA o anticorpi immobilizzati su una superficie dell'elettrodo per quantification contenuto molecolare.

Il metodo Efirm è vantaggioso per l'estrazione di esosomi e scarico merci per analisi senza tampone di lisi. Questo metodo è in grado di eseguire il rilevamento preciso dei due bersagli di RNA e proteine ​​biomarcatori nella exosome. Efirm estrae esosomi specificamente in base alle loro marcatori di superficie al contrario di tecniche basate dimensioni.

La microscopia elettronica a trasmissione (TEM) e test dimostrano la funzionalità del metodo per exosome acquisizione e l'analisi. Il metodo è stato applicato a Efirm exosomal analisi di 9 topi iniettati con le cellule H640 cancro del polmone umano (una linea cellulare trasfettata per esprimere il marcatore exosome umana CD63-GFP), al fine di testare il loro profilo exosome contro 11 topi che ricevono controlli saline. Elevati livelli di biomarkers exosomal (riferimento gene GAPDH e proteine ​​marcatori superficie umana CD63-GFP) sono stati trovati per l'H640 iniettato topi in entrambi i campioni di siero e saliva. Inoltre, saliva e campioni di siero sono stati dimostrato di avere linearità (R = 0,79). Questi risultati sono suggestivi per la vitalità di biomarcatori exosome salivari per la rilevazione di malattie distali.

Introduction

Ricerca Exosome è un settore emergente della ricerca che esamina microvescicole lipidiche che portano RNA ^{1, 2} DNA e proteine ^​​3 cargo. Precedenti indagini exosome biologia hanno portato alla identificazione di esosomi in biofluidi come il sangue ^{4, 5} urine, latte materno ^6, e ⁷ saliva. Studi hanno dimostrato che esosomi giocano un ruolo in diverse vie cellulari, meditazione remoto comunicazione tra diversi sistemi del corpo ^8. A causa del ruolo esosomi giocano nella comunicazione intercellulare, si ipotizza che possano pacchetto obiettivi biomolecole (proteine, RNA e DNA) correlati con stati patologici. In vitro ³ e modello animale ⁹ studi sembrano confermare questa ipotesi. In indagando contenuti exosomal per la scoperta di biomarcatori, è necessario sviluppare una metodologia per l'isolamento selettivo exosome da biofluidi, expulsi indottosu di carico da esosomi, e la quantificazione di biomolecole exosome. Nella misura di questo lavoro, exosomes saranno definite come una struttura avente un diametro di circa 70-100 nm e possedendo superficie marcatore CD63.

I ricercatori in genere prima purificano exosomes di ultracentrifugazione ¹⁰ e poi elaborare il contenuto exosomal attraverso l'utilizzo di kit tampone di lisi. L'utilizzo di metodi tampone di lisi richiede tempi di incubazione che vanno da minuti a ore. Questo processo può potenzialmente danneggiare exosome carico e portare a campione degrado. Ad esempio, salivare RNA exosome rilasciato tramite tampone di lisi nell'ambiente extracellulare circostante possiede una emivita di sotto 1 min, rendendo la misurazione di exosomal post-RNA Lysis Buffer un compito particolarmente difficile senza l'aggiunta di reagenti stabilizzazione ^11. L'effetto composto di aggiungere vari reagenti per la lisi e la stabilizzazione può introdurre agenti che complicano e interferire con la analysis di contenuti exosomal. Un approccio alternativo può essere utile per lo scarico rapidamente contenuti exosomal e conservare in modo sicuro il carico per la caratterizzazione.

In questo lavoro, si propone l'utilizzo di un campo elettrico non uniforme per il rilascio di contenuti exosomal. Campi elettrici sono stati conosciuti per portare la capacità di polarizzare e disturbare il doppio strato lipidico che forma membrane cellulari. Il nostro lavoro sperimentale esplora l'uso di non-uniforme onde quadre ciclici (CSW) per interrompere la struttura microvesicle di esosomi e rilasciando merci trasportate. Questo metodo utilizza tensioni in diverse centinaia di millivolt gamma, il che significa che la maggior parte delle biomolecole non saranno interrotte. Abbiamo dimostrato che l'utilizzo di un'onda ciclica quadrati è in grado di comandare il rilascio di salivare exosome contenuti mRNA nell'ambiente fluido circostante. Questa versione del contenuto exosomal è perfettamente integrato con un sistema di elettrodi che può essere usato per quantificare i livelli di espressione biomarker ^12,13. Questo metodo proposto consente una rapida, sensibile, e tampone di lisi analisi prive di contenuti exosome.

Figura 1. Panoramica Efirm ^Workflow.. Il metodo Efirm è sostanzialmente divisa in tre principali fasi che sono necessarie per la purificazione e esosomi analisi.

Questo metodo di rilascio e di analisi dei contenuti exosomal basato CSW viene utilizzato in combinazione con microsfere magnetiche specifici CD63 per l'isolamento exosome. Queste perle di CD63-affinità consentono l'isolamento selettivo di esosomi da campioni salivari (e altri fluidi biologici). Dopo l'incubazione e l'estrazione dei esosomi utilizzando le perle magnetizzati, le perle sono migrati al sistema sensore elettrochimico per la CSW basato rilascio contenuto e parte l'analisi dell'esperimento. Figura 1 fornisce una panoramica del lavoroflusso del metodo Efirm.

Protocol

1. Magnetic Exosome Estrazione basata su Bead Pipettare una soluzione ben miscelato di 5 ml di microparticelle magnetiche rivestite di streptavidina in 495 ml di tampone fosfato salino (PBS) in una provetta per risospendere le sfere. Lavare e risospendere le sfere con 500 ml di PBS per tre volte di utilizzare una griglia magnetica. La cremagliera è una matrice di magneti sul lato di un'unità abitativa che può contenere i tubi campione microcentrifuga. Per ogni lavaggio, prima lasciate che i tu…

Representative Results

Validazione di Exosome Cattura di Beads Uso TEM Isolamento di esosomi da saliva utilizzando sfere magnetiche CD63 anti-umani è stato convalidato dopo protocollo di estrazione mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM) immagini. TEM mostra sfere magnetiche con granuli 70-100 nm immediatamente adiacenti (vedi Figura 3A, 3B e), in coerenza con il profilo noto di esosomi. Nessun 70-100 granuli nm sono stati osservati per le sfere magnetiche di saliva…

Discussion

Come i risultati indicano, CD63 anti-umana rivestite nanoparticelle magnetiche sono in grado di catturare specificamente piccole particelle che hanno una dimensione che varia 70-100 nm. Questa particella catturata è coerente con il profilo precedentemente osservata di esosomi. Inoltre, l'utilizzo del CSW bassa tensione in seguito alla cattura delle particelle è indicata per rimuoverli dalla superficie tallone e causare profili degradazione DNA simile a quello di un metodo tradizionale tampone di lisi base per il r…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Helios 16-Channel Reader System with Chip Interface	Genefluidics, USA	RS-1000-16
16X Sensor Chip, Bare Gold, pack of 5 chips	Genefluidics, USA	SC1000-16X-B
Biotinylated anti-human CD63 Antibody	Ancell, USA	215-030
Dynabeads MyOne Streptavidin T1	Invitrogen, USA	65601
Neodynium Magnetics ( 1/10" dia. x 1/32" thick)	K&J Magnetics, USA	DH101
Ultrapure Distilled Water	Life Technologies, USA	10977-023
Mettler Toldeo 3M KcL Solution	Fisher Scientific, USA	1911512
Pyrrole	Sigma-Aldrich, USA	W338605-100g
Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments	Roche, Germany	11426346910
3, 3′, 5, 5′ tetramethylbenzidine substrate (TMB/H2O2, low activity)	Neogen, Usa	330175
Phosphate Buffered Saline Solution	Life Technologies, USA	10010023
Casein/PBS	Fisher Scientific, USA	37532