Elektrik Alan-kaynaklı Release ve Ölçme (EFIRM) tarafından Exosomal Biomarker Algılama
Summary
Exosomes are microvesicular structures found within biofluids that potentially carry important disease discriminatory biomarkers. Here, a novel method is used to specifically extract exosomes and rapidly test the exosomal cargo for both RNA/protein targets following the disruption of exosomes using non-uniform electric cyclic square waves.
Abstract
Eksozomlar arası iletişimde bir aracı rolü mikroveziküler yapılardır. Onlar hastalık ayrımcı biyomarkerlar taşımak olmadığını belirlemek için eksozom iç kargo incelemek için ilgi olduğunu. Exosomal analizinin yapılması için, ayıklanması ve iç içeriği zarar vermeden hedef Biofluids gelen eksozomlar analiz etmek için bir yöntem geliştirilmesi gerekmektedir.
Elektrik alan ile indüklenen salma ve ölçüm (EFIRM) özel olarak, Biofluids gelen eksozomlar açılan kendi yük boşaltma ve iç RNA / protein içeriği test etmek için bir yöntemdir. Bir anti-insan CD63 özgü antikor manyetik mikropartikül kullanarak, eksozomlar ilk Biofluids çökeltilir. Aşağıdaki çıkarma, düşük voltajlı elektrik siklik kare dalgalar (CSW) veziküler membran bozabilir ve kargo boşaltma neden uygulanır. eksozom içeriği nereye için bir elektrot yüzeyi üzerinde hareketsiz DNA primerleri veya antikorlar hibridize edilirMoleküler içeriğin ntification.
EFIRM yöntemi liziz tamponu olmayan analizi için eksozom ekstre ve boşaltılması için avantajlıdır. Bu yöntem, eksozom hem RNA ve protein biyomarker hedeflerin belirli bir algılama gerçekleştirme yeteneğine sahiptir. Boyut-tabanlı teknikler aksine EFIRM özellikle yüzey belirteçleri dayalı eksozomlar ayıklar.
Transmisyon elektron mikroskopisi (TEM) ile tahlil eksozom yakalama ve analiz için bir yöntem işlevselliğini gösterir. EFIRM yöntem, insan akciğer kanseri H640 hücreleri enjekte 9 farelerin analizi tuzlu kontrolleri alan 11 fareden karşı eksozom profili test etmek için (eksozom işaretleyici insan CD63, GFP ifade eden transfekte edilmiş bir hücre hattı) exosomal uygulandı. Exosomal biyobelirteçlerinin Artmış düzeyleri (referans gen GAPDH ve protein yüzey işaretleyici insan CD63-GFP) H640 hem serum ve tükürük örneklerinde fareler enjekte bulunamadı. Ayrıca Saliva ve serum numuneleri doğrusallık (R, = 0.79) sahip olduğu gösterilmiştir. Bu sonuçlar uzak hastalıkların tespiti için tükürük eksozom biyobelirteçlerinin canlılığı düşündürür.
Introduction
Exosome araştırma RNA 1, DNA 2, ve protein 3 kargo taşıyan lipit microvesicles inceleyen bir araştırma ortaya çıkan bir alandır. Eksozom biyoloji Önceki araştırmalar, kan 4, idrar 5, anne sütü 6 ve tükürük 7 gibi Biofluids içinde eksozom belirlenmesine yol açmıştır. Çalışmalar uzaktan gövdenin 8 farklı sistemler arasında iletişimi meditating, eksozomlar farklı hücresel yolların bir rol oynadığını göstermiştir. Rolü eksozomlar hücrelerarası iletişimi oynamak için, onlar hastalık durumları ile ilişkili biyomolekülün hedefleri (protein, RNA ve DNA) paket olabileceği düşünülebilir. In vitro 3 ve hayvan modeli 9 çalışmalar bu hipotezi doğrular görünmektedir. Biyomarkır keşif için exosomal içerik araştıran, bu Biofluids seçici eksozom izolasyonu için bir metodoloji geliştirmek için gerekli olan, uyarılan expulsieksozom gelen kargo ve eksozom biyomoleküllerin miktarının on. Bu çalışmanın kapsamında, eksozomlar bir yapı yaklaşık 70-100 nm arasında bir çapa sahip olan ve yüzey işaretleyici CD63 sahip olarak tarif edilecektir.
Araştırmacılar genellikle ilk Ultrasantrifügasyon 10 ile eksozomlar arındırmak ve daha sonra lizis tamponu kitleri kullanımı yoluyla exosomal içeriğini işlemek. Liziz tamponu yöntemlerin kullanımı dakika saat arasında değişen bir bekleme süresi gerektirir. Bu süreç, potansiyel eksozom kargo zarar ve bozulmasını örnek yol açabilir. Örnek olarak, çevreleyen hücre dışı ortama liziz tamponu üzerinden serbest tükürük eksozom RNA exosomal RNA sonrası liziz ölçümü stabilizasyon tepkin 11 eklenmeden özellikle zor bir görev tampon hale 1 dakika altında bir yarı ömre sahip bulunmaktadır. lizis ve istikrar için çeşitli reaktifler ekleyerek bileşik etkisi komplike ajanları tanıtmak ve analı müdahale edebilirexosomal içeriğinin sis. Alternatif bir yaklaşım, hızlı bir şekilde exosomal içeriği boşaltma ve güvenli bir şekilde tanımlanması için yük korunması için yararlı olabilir.
Bu çalışmada, exosomal içeriğin salınımı için bir tek biçimli olmayan elektrik alanının kullanımını önermektedir. Elektrikli alanları polarize ve hücre zarlarını oluşturan lipid çift bozma yeteneği taşımak için bilinmektedir. Bizim deneysel çalışmalar eksozomlann microvesicle yapısının bozulması ve taşınan kargo serbest bırakılması için düzgün olmayan siklik kare dalgalar (CSW) kullanımını araştırıyor. Bu yöntem en biyomoleküllerin kesintiye olmayacak anlamına birkaç yüz milivolt aralığında gerilimleri kullanır. Bir siklik kare dalga kullanımı çevreleyen akışkan ortama tükürük eksozom mRNA içeriği serbest harekete geçirmek için mümkün olduğunu göstermektedir. Exosomal içeriğin Bu sürüm, sorunsuz bir şekilde biyomarker ekspresyon seviyelerini ölçmek için kullanılabilecek bir elektrot sistemi ile entegre 12,13.. Önerilen bu yöntem, eksozom içeriğinin hızlı, hassas ve parçalama tamponu ücretsiz analiz sağlar.
EFIRM İş Akışı 1. Genel Bakış Şekil.. EFIRM yöntemi geniş arındırıcı ve analiz eksozom için gerekli olan üç ana evreye ayrılır.
Bu SSG göre exosomal içeriği serbest bırakılması ve analiz yöntemi eksozom izolasyonu için CD63 spesifik manyetik mikro ile bağlantılı olarak kullanılır. Bu CD63-afinite taneleri tükürük örnekleri (ve diğer Biofluids) için eksozom seçici izolasyonu için izin verir. İnkübasyon ve manyetize boncuklar kullanarak eksozom çıkarılması ardından, boncuk Şekil 1. Içerik salınımını ve deney analizi bölümünü tabanlı CSW için elektrokimyasal sensör sistemi göç işin bir bakış verir edilirEFIRM yöntemi akar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sonuçlar gösterdiği gibi, anti-insan CD63 kaplı manyetik nanopartikülleri, özellikle 70-100 nm arasında değişen bir boyuta sahiptir, küçük parçacıkları yakalamak mümkündür. Çekilecek parçacık eksozom daha önce gözlenen profili ile tutarlıdır. Bundan başka, parçacıklar yakalanmasından sonra düşük voltajlı CSW kullanım boncuğun yüzeyine kaldırmak ve kargo serbest bırakılması için geleneksel bir liziz tamponu göre yöntem ile benzer DNA parçalanma profilleri neden olduğu da göst…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Ulusal Araştırma Kaynakları Merkezi ve (FW) Hibe UL1TR000124 aracılığıyla Translational Sciences, Ulusal Sağlık Enstitüleri, Advancing Ulusal Merkezi tarafından desteklenen; Felix & Mildred Yip donatılmış Profesörlük ve (DTWW için) Barnes Aile Fonu, (MT) Ödül Numarası T90DE022734 altında Ulusal Sağlık Enstitüleri Diş & Kranyofasiyal Research Ulusal Enstitüsü. içerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmemektedir.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Helios 16-Channel Reader System with Chip Interface | Genefluidics, USA | RS-1000-16 | |
| 16X Sensor Chip, Bare Gold, pack of 5 chips | Genefluidics, USA | SC1000-16X-B | |
| Biotinylated anti-human CD63 Antibody | Ancell, USA | 215-030 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Invitrogen, USA | 65601 | |
| Neodynium Magnetics ( 1/10" dia. x 1/32" thick) | K&J Magnetics, USA | DH101 | |
| Ultrapure Distilled Water | Life Technologies, USA | 10977-023 | |
| Mettler Toldeo 3M KcL Solution | Fisher Scientific, USA | 1911512 | |
| Pyrrole | Sigma-Aldrich, USA | W338605-100g | |
| Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments | Roche, Germany | 11426346910 | |
| 3, 3′, 5, 5′ tetramethylbenzidine substrate (TMB/H2O2, low activity) | Neogen, Usa | 330175 | |
| Phosphate Buffered Saline Solution | Life Technologies, USA | 10010023 | |
| Casein/PBS | Fisher Scientific, USA | 37532 |
References
- Rabinowits, G., Gerçel-Taylor, C., Day, J. M., Taylor, D. D., Kloecker, G. H. Exosomal MicroRNA: A Diagnostic Marker for Lung Cancer. Clinical Lung Cancer. 10 (1), 42-46 (2009).
- Thakur, B. K., et al. Double-stranded DNA in exosomes: a novel biomarker in cancer detection. Cell Research. 24 (6), 766-769 (2014).
- Lau, C. S., Wong, D. T. W. Breast Cancer Exosome-like Microvesicles and Salivary Gland Cells Interplay Alters Salivary Gland Cell-Derived Exosome-like Microvesicles In. Vitro. PLoS ONE. 7 (3), e33037 (2012).
- Bala, S., et al. Circulating microRNAs in exosomes indicate hepatocyte injury and inflammation in alcoholic, drug-induced, and inflammatory liver diseases. Hepatolog. 56 (5), 1946-1957 (2012).
- Dear, J. W., Street, J. M., Bailey, M. A. Urinary exosomes: A reservoir for biomarker discovery and potential mediators of intrarenal signalling. Proteomics. 13 (10-11), 1572-1580 (2013).
- Lässer, C., et al. Human saliva, plasma and breast milk exosomes contain RNA: uptake by macrophages. Journal of Translational Medicine. 9 (1), 9 (2011).
- Palanisamy, V., et al. Nanostructural and Transcriptomic Analyses of Human Saliva Derived Exosomes. PLoS ONE. 5 (1), e8577 (2010).
- Camussi, G., et al. Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication. Kidney International. 78 (9), 838-848 (2010).
- Lau, C., et al. Role of pancreatic cancer-derived exosomes in salivary biomarker development. The Journal of Biological Chemistry. 288 (37), 26888-26897 (2013).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and Characterization of Exosomes from Cell Culture Supernatants and Biological Fluids. Current Protocols in Cell Biology. 3 (22), (2001).
- Park, N. J., Li, Y., Yu, T., Brinkman, B. M. N., Wong, D. T. Characterization of RNA in Saliva. Clinical Chemistry. 52 (6), 988-994 (2006).
- Wei, F., et al. Bio/Abiotic Interface Constructed from Nanoscale DNA Dendrimer and Conducting Polymer for Ultrasensitive Biomolecular Diagnosis. Small. 5 (15), 1784-1790 (2009).
- Wei, F., et al. Electrochemical Sensor for Multiplex Biomarkers Detection. Clinical Cancer Research. 15 (13), 4446-4452 (2009).
- Wei, F., Yang, J., Wong, D. T. W. Detection of exosomal biomarker by electric field-induced release and measurement (EFIRM). Biosensors and Bioelectronics. 44, 115-121 (2013).
