Detectie van exosomaal Biomarker door Electric Field-geïnduceerde Release and Measurement (Efirm)

Summary

Exosomes are microvesicular structures found within biofluids that potentially carry important disease discriminatory biomarkers. Here, a novel method is used to specifically extract exosomes and rapidly test the exosomal cargo for both RNA/protein targets following the disruption of exosomes using non-uniform electric cyclic square waves.

Abstract

Exosomen zijn microvesicular structuren die een bemiddelende rol in intercellulaire communicatie spelen. Het is van belang om de interne lading exosomes onderzoeken om te bepalen of ze dragen ziekte discriminerende biomarkers. Voor het uitvoeren exosomaal analyse moet een werkwijze voor het extraheren en analyseren exosomes van target biovloeistoffen zonder de interne inhoud te ontwikkelen.

Elektrisch veld geïnduceerde vrijkomen en meting (Efirm) is een methode voor specifiek extraheren exosomen uit biovloeistoffen, lossen hun lading, en het testen van hun interne RNA / eiwitgehalte. Met behulp van een anti-humaan CD63 specifiek antilichaam magnetische microdeeltjes worden exosomes eerst geprecipiteerd uit biovloeistoffen. Na extractie, low-voltage elektrische cyclische blokgolven (CSW) worden toegepast op de vesiculaire membraan verstoren en leiden tot lading lossen. De inhoud van de exosome gehybridiseerd met DNA-primers of antilichamen geïmmobiliseerd op een elektrodeoppervlak voor quantification van moleculaire inhoud.

De Efirm werkwijze is voordelig voor de extractie van exosomes en lossen van vracht analyse zonder lysis buffer. Deze methode is in staat om specifieke detectie van RNA en eiwit biomarker doelen in de exosoom. Efirm extracten exosomes precies gebaseerd op hun oppervlak markers tegenstelling maat gebaseerde technieken.

Transmissie elektronenmicroscopie (TEM) en test tonen de functionaliteit van de werkwijze voor exosoom acquisitie en analyse. De Efirm methode werd gebruikt voor analyse van 9 muizen geïnjecteerd met menselijke longkanker H640 cellen (een cellijn getransfecteerd met de humane exosoom marker CD63-GFP expressie) om hun exosome profiel testen tegen 11 muizen die zoutoplossing controles exosomaal. Verhoogde niveaus van exosomaal biomarkers (referentie-gen GAPDH en eiwitoppervlak marker menselijk CD63-GFP) werden gevonden voor de H640 geïnjecteerde muizen in zowel serum en speeksel. Bovendien saliva en serummonsters werden aangetoond lineariteit (R = 0,79) hebben. Deze resultaten zijn suggestief voor de levensvatbaarheid van speeksel exosome biomarkers voor detectie van distale ziekten.

Introduction

Exosome onderzoek is een opkomende gebied van onderzoek dat lipide microvesicles dat RNA ^1, DNA ^2, en eiwit ³ lading te vervoeren onderzoekt. Eerdere onderzoeken van exosome biologie hebben geleid tot de identificatie van exosomen in biovloeistoffen zoals bloed ^{4, 5} urine, moedermelk ^6, en speeksel ^7. Studies hebben aangetoond dat exosomes spelen een rol in verschillende cellulaire responsen op afstand mediteren communicatie tussen verschillende systemen van het lichaam ^8. Vanwege de rol exosomes spelen bij intercellulaire communicatie, wordt verondersteld dat ze biomolecule targets (eiwit, RNA en DNA) gecorreleerd met ziektetoestanden kunnen verpakken. In vitro ³ en diermodel ⁹ studies lijken deze hypothese te bevestigen. Bij het onderzoek exosomaal inhoud ontwikkeling van biomerkers, moet een methode voor selectieve isolatie van exosome biovloeistoffen ontwikkelen geïnduceerde expulsiop van de lading van exosomen, en kwantificatie van exosome biomoleculen. In de omvang van deze werkzaamheden zal exosomes gedefinieerd als een structuur met een diameter van ongeveer 70-100 nm en bezitten oppervlaktemarker CD63.

Onderzoekers normaliter eerst zuiveren exosomen door ultracentrifugeren ¹⁰ en dan verwerken exosomaal inhoud door het gebruik van lysebuffer kits. Gebruik lysisbuffer methoden vereist incubatietijden variëren van minuten tot uren. Dit proces kan in potentie schadelijk exosome lading en leiden tot degradatie proeven. Bijvoorbeeld, speeksel exosome RNA vrijkomt door lysis buffer in de omringende extracellulaire omgeving bezit een halfwaardetijd van minder dan 1 minuut, de meting van exosomaal RNA na lysis buffer bijzonder moeilijk zonder toevoeging van stabilisatie reagentia ^11. De samengestelde effect van het toevoegen van verschillende reagentia voor lysis en stabilisatie kunnen middelen die compliceren voeren en interfereren met de analysis van exosomaal inhoud. Een alternatieve benadering kan nuttig zijn voor het snel lossen exosomaal inhoud en veilig bewaren van de lading voor het karakteriseren zijn.

In dit werk, stellen wij het gebruik van een niet-uniform elektrisch veld voor de vrijlating van exosomaal inhoud. Elektrische velden is bekend dat het vermogen tot polariseren en verstoren de lipide dubbellaag die celmembranen vormt dragen. Onze experimentele werk onderzoekt het gebruik van niet-uniforme cyclische blokgolven (CSW) voor het verstoren van de microvesicle structuur van exosomen en het vrijgeven uitgevoerd lading. Deze methode maakt gebruik van spanningen in de honderden millivolt bereik, wat betekent dat de meeste biomoleculen niet worden verstoord. We tonen aan dat het gebruik van een cyclisch blokgolf kan afgifte van speeksel exosome mRNA gehalte bedienen in het omringende vloeibare omgeving. Deze versie van exosomaal inhoud naadloos geïntegreerd met een elektrode systeem dat kan worden gebruikt om de biomarker expressieniveaus kwantificeren ^12,13. De voorgestelde werkwijze maakt snelle, gevoelige en lysis buffer vrij analyse van exosome inhoud.

Figuur 1. Overzicht van Efirm ^Workflow.. De Efirm methode is in grote lijnen verdeeld in de drie grote fasen die nodig zijn voor het zuiveren en analyseren exosomen zijn.

Deze CSW gebaseerd exosomaal inhoud vrijkomen en analyse methode wordt gebruikt in combinatie met CD63-specifieke magnetische microbolletjes voor exosome isolement. Deze CD63-affiniteitskorrels zorgen voor de selectieve isolatie van exosomen uit speeksel monsters (en andere biovloeistoffen). Na incubatie en extractie van exosomen gebruik de gemagnetiseerde kralen, zijn de kralen gemigreerd naar de elektrochemische sensor systeem voor de CSW gebaseerde inhoud vrijkomen en analyse deel van het experiment. Figuur 1 geeft een overzicht van het werkstromen van de Efirm methode.

Protocol

1. Magnetische Bead-gebaseerde exosome Extraction Pipetteer een goed gemengde oplossing van 5 ul van Streptavidine-gecoate magnetische microdeeltjes in 495 ui met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) buffer in een microcentrifugebuis om de kralen resuspenderen. Was en resuspendeer de kralen met 500 pl PBS driemaal met een magnetische rek. Het rek is een array van magneten op de zijkant van een wooneenheid dat het monster reactievaatjes kan houden. Voor elke wasbeurt, laten we eerst de buizen zitten…

Representative Results

Validatie van exosome Capture van Beads behulp TEM Isolatie van exosomen uit speeksel behulp van anti-humaan CD63 magnetische parels werd gevalideerd na extractie protocol door transmissie elektronenmicroscopie (TEM) beelden. TEM toont magnetische korrels met 70-100 nm korrels onmiddellijk grenzend (zie figuur 3A en 3B), consistent met het bekende profiel van exosomes. Nr 70-100 nm granules werden waargenomen voor de magnetische kralen in sp…

Discussion

Als resultaat geven, anti-humaan CD63 beklede magnetische nanodeeltjes kunnen bijzonder kleine deeltjes die een grootte variërend 70-100 nm vangen. Deze gevangen deeltjes is in overeenstemming met de eerder waargenomen profiel van exosomes. Bovendien wordt het gebruik van de laagspannings-CSW na het vangen van de deeltjes aangetoond dat ze van de kraal oppervlak te verwijderen en veroorzaken DNA degradatie dat overeenstemt met dat van een traditionele lysisbuffer methode voor lading release. Deze gegevens duiden erop d…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Helios 16-Channel Reader System with Chip Interface	Genefluidics, USA	RS-1000-16
16X Sensor Chip, Bare Gold, pack of 5 chips	Genefluidics, USA	SC1000-16X-B
Biotinylated anti-human CD63 Antibody	Ancell, USA	215-030
Dynabeads MyOne Streptavidin T1	Invitrogen, USA	65601
Neodynium Magnetics ( 1/10" dia. x 1/32" thick)	K&J Magnetics, USA	DH101
Ultrapure Distilled Water	Life Technologies, USA	10977-023
Mettler Toldeo 3M KcL Solution	Fisher Scientific, USA	1911512
Pyrrole	Sigma-Aldrich, USA	W338605-100g
Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments	Roche, Germany	11426346910
3, 3′, 5, 5′ tetramethylbenzidine substrate (TMB/H2O2, low activity)	Neogen, Usa	330175
Phosphate Buffered Saline Solution	Life Technologies, USA	10010023
Casein/PBS	Fisher Scientific, USA	37532