Påvisning av Exosomal Biomarkør av elektrisk felt-indusert Slipp og måling (EFIRM)

Summary

Exosomes are microvesicular structures found within biofluids that potentially carry important disease discriminatory biomarkers. Here, a novel method is used to specifically extract exosomes and rapidly test the exosomal cargo for both RNA/protein targets following the disruption of exosomes using non-uniform electric cyclic square waves.

Abstract

Exosomes er microvesicular strukturer som spiller en meklerrolle i interkommunikasjon. Det er av interesse å studere i laste av exosomes å finne ut om de bærer sykdoms diskriminerende biomarkører. For å utføre exosomal analyse, er det nødvendig å utvikle en metode for ekstrahering og analyse av exosomes fra target biofluids uten å skade det indre innhold.

Elektrisk felt-indusert frigjøring og måling (EFIRM) er en metode for spesielt trekke ut exosomes fra biofluids, lossing sin last, og teste deres interne RNA / protein innhold. Ved hjelp av et anti-humant CD63-spesifikt antistoff magnetiske mikropartikkel, er exosomes først utfelt fra biofluids. Etter ekstraksjon, lavspente elektriske sykliske firkantbølger (CSW) er brukt for å forstyrre vesicular membran og føre last lossing. Innholdet i exosome blir hybridisert til DNA-primere eller antistoffer immobilisert på en elektrodeoverflate for quantification av molekylær innhold.

Den EFIRM metoden er fordelaktig for utvinning av exosomes og lossing last for analyse uten lysisbuffer. Denne metoden er i stand til å utføre spesifikk påvisning av både RNA- og protein biomarkør mål i exosome. EFIRM ekstrakter exosomes spesielt basert på deres overflatemarkører i motsetning til størrelse baserte teknikker.

Transmisjonselektronmikroskopi (TEM) og analysen viser funksjonaliteten av fremgangsmåten for exosome fangst og analyse. Den EFIRM metode ble anvendt for å exosomal analyse av ni mus injisert med human lungekreft H640-celler (en cellelinje transfektert for å uttrykke exosome markør human CD63-GFP) for å teste deres exosome profil mot 11 mus som mottok saltløsningskontrollene. Forhøyede nivåer av exosomal biomarkører (referanse genet GAPDH og protein overflaten markør human CD63-GFP) ble funnet for den H640 injisert mus i både serum og spyttprøver. Videre saliva, og serumprøver ble vist å ha linearitet (R = 0,79). Disse resultatene er tankevekkende for levedyktigheten av spytt exosome biomarkører for påvisning av distale sykdommer.

Introduction

Exosome forskning er et voksende felt av etterforskningen som undersøker lipid mikrovesikler som bærer RNA ^1, DNA ^to, og protein ^tre last. Tidligere undersøkelser av exosome biologi har ført til identifisering av exosomes i biofluids som blod ^4, urin ^5, morsmelk ^6, og spytt ^7. Studier har vist at exosomes spille en rolle i forskjellige cellulære veier, eksternt meditere kommunikasjon mellom forskjellige systemer i kroppen ^8. På grunn av den rollen exosomes spille i inter kommunikasjon, er det en hypotese om at de kan pakke biomolekyl mål (protein, RNA, og DNA) korrelerte med sykdomstilstander. In vitro ^tre og dyremodell ⁿⁱ studier synes å bekrefte denne hypotesen. I å undersøke exosomal innhold for biomarkører, er det nødvendig å utvikle en metode for selektiv exosome isolasjon fra biofluids, indusert expulsipå av last fra exosomes, og kvantifisering av exosome biomolekyler. I den utstrekning av dette arbeidet, vil exosomes bli definert som en struktur med en diameter på omtrent 70 til 100 nm og besitter overflatemarkører CD63.

Forskere typisk først rense exosomes av ultrasentrifugering ¹⁰ og deretter behandle exosomal innhold gjennom bruk av lysis buffer kits. Bruk av lyseringsbuffer metoder krever inkubasjonstider som strekker seg fra minutter til timer. Denne prosessen kan potensielt skade exosome last og føre til prøve degradering. For eksempel, spytt exosome RNA frigitt via lysisbuffer i det omgivende ekstracellulære miljøet besitter en halveringstid på under ett minutt, noe som gjør måling av exosomal RNA post-lysisbuffer en særlig vanskelig oppgave uten tilsetning av stabiliserings reagenser ^11. Forverret effekten av å legge ulike reagenser for lysering og stabilisering kan innføre midler som vanskelig og forstyrre analysis av exosomal innhold. En alternativ tilnærming kan være nyttig for hurtig lossing exosomal innhold og trygt å bevare lasten for karakterisering.

I dette arbeidet, foreslår bruken av et ikke-uniformt elektrisk felt for frigjøring av exosomal innhold. Elektrisk-felt er kjent for å bære evne til å polarisere og forstyrre det ytre lipid bilaget som danner cellemembraner. Vår eksperimentelt arbeid utforsker bruk av uensartede sykliske firkantbølger (CSW) for å forstyrre mikrovesikkelen strukturen i exosomes og slippe gjennomført last. Denne metoden bruker spenninger i flere hundre millivolt rekkevidde, noe som betyr at de fleste biomolekyler ikke vil bli forstyrret. Vi viser at bruken av en cyklisk-firkantbølge er i stand til å aktivere frigjøring av spytt exosome mRNA-innholdet i det omgivende fluidmiljø. Denne utgaven av exosomal innhold er sømløst integrert med en elektrode system som kan brukes til å kvantifisere biomarkør uttrykk nivåer ^12,13. Denne foreslåtte metoden gjør det mulig for rask, følsom, og lysisbuffer gratis analyse av exosome innhold.

Figur 1. Oversikt over EFIRM ^{arbeidsflyt..} The EFIRM metode grovt deles inn i tre hovedfaser som er nødvendige for å rense og analysere exosomes.

Dette CSW basert exosomal innhold utgivelsen og analysemetode er brukt i forbindelse med CD63-spesifikke magnetiske mikroperler for exosome isolasjon. Disse CD63-affinitet perler gir mulighet for selektiv isolering av exosomes fra spyttprøver (og andre biofluids). Etter inkubering og utvinning av exosomes ved hjelp av de magnetiserte kuler, blir kulene overført til den elektrokjemiske sensorsystemet for CSW basert innhold frigjøring og analysedelen av forsøket. Figur 1 gir en oversikt over arbeidetflyt av EFIRM metoden.

Protocol

1. Magnetisk Bead-baserte Exosome Extraction Pipetter en godt blandet løsning av 5 ul streptavidin-belagte magnetiske mikropartikler i 495 ul av fosfatbufret saltvann (PBS) buffer i et mikrosentrifugerør for å resuspendere kulene. Vask og resuspender perlene med 500 mL PBS tre ganger ved hjelp av en magnetisk rack. Stativet er en rekke magneter på siden av en boenhet som kan holde prøve mikrosentrifugerør. For hver vask, først la rørene sitte på pinebenken i 1 minutt, og deretter bruke en pi…

Representative Results

Validering av Exosome Capture av Perler Bruke TEM Isolering av exosomes fra spytt ved hjelp av anti-humane CD63 magnetiske kuler ble validert etter ekstraksjon protokoll ved hjelp av transmisjonselektronmikroskopi (TEM) bilder. TEM viser magnetiske kuler med 70-100 nm granulater umiddelbart hosliggende (se figur 3A og 3B), i samsvar med den kjente profil exosomes. Ingen 70-100 nm korn ble observert for de magnetiske kuler i spytt som ikke ha…

Discussion

Som resultatene viser, anti-human CD63 belagte magnetiske nanopartikler er i stand til spesifikt å fange opp små partikler som har en størrelse i området 70-100 nm. Dette fanges partikkel er i overensstemmelse med den tidligere observerte profil exosomes. Videre er bruken av lavspent CSW etter fangst av partiklene vist seg å fjerne dem fra kuleoverflaten og forårsake DNA-degraderingsprofil lik den i et tradisjonelt lysisbuffer basert metode for frigjøring av last. Disse dataene indikerer at arbeidsflyten av exoso…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Helios 16-Channel Reader System with Chip Interface	Genefluidics, USA	RS-1000-16
16X Sensor Chip, Bare Gold, pack of 5 chips	Genefluidics, USA	SC1000-16X-B
Biotinylated anti-human CD63 Antibody	Ancell, USA	215-030
Dynabeads MyOne Streptavidin T1	Invitrogen, USA	65601
Neodynium Magnetics ( 1/10" dia. x 1/32" thick)	K&J Magnetics, USA	DH101
Ultrapure Distilled Water	Life Technologies, USA	10977-023
Mettler Toldeo 3M KcL Solution	Fisher Scientific, USA	1911512
Pyrrole	Sigma-Aldrich, USA	W338605-100g
Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments	Roche, Germany	11426346910
3, 3′, 5, 5′ tetramethylbenzidine substrate (TMB/H2O2, low activity)	Neogen, Usa	330175
Phosphate Buffered Saline Solution	Life Technologies, USA	10010023
Casein/PBS	Fisher Scientific, USA	37532