Analysera effekterna av stromaceller celler på rekrytering av leukocyter från Flow

Summary

Förmågan hos inflammerat endotel att rekrytera leukocyter från flödet regleras av mesenkymala stromaceller. Vi beskriver två in vitro-modeller innehåller primära humana celler som kan användas för att bedöma neutrofila rekrytering från flödet och undersöka vilken roll mesenkymala stromaceller spela i regleringen av denna process.

Abstract

Stromalceller reglerar rekryteringen av cirkulerande leukocyter under inflammation genom överhörning med grann endotelceller. Här beskriver vi två in vitro "kärl" modeller för att studera rekrytering av cirkulerande neutrofiler från flödet av inflammerade endotelceller. En stor fördel med dessa modeller är förmågan att analysera varje steg i leukocytadhesionen kaskad i ordning, som skulle uppträda in vivo. Vi beskriver också hur båda modellerna kan anpassas för att studera rollen av stromaceller, i detta fall mesenkymala stamceller (MSC), i regleringen av leukocytrekrytering.

Primära endotelceller odlades ensamma eller tillsammans med humant MSC i direkt kontakt på Ibidi microslides eller på motsatta sidor av en Transwell-filter under 24 timmar. Kulturer stimulerades med tumömekrosfaktor alfa (TNFa) under 4 h och införlivas i en flödesbaserad vidhäftningsanalys. En bolus av neutrofiler perfunderadesöver endotelet under 4 min. Fångst av flödande neutrofiler och deras interaktioner med endotelet visualiserades genom faskontrastmikroskopi.

I båda modellerna, ökad cytokin-stimulering endothelial rekrytering av flödande neutrofiler i ett dosberoende sätt. Analys av beteendet av rekryterade neutrofiler uppvisade en dosberoende minskning i valsning och en dosberoende ökning av transmigration genom endotelet. I co-kultur, MSC tryckt neutrofiladhesion till TNF-stimulerad endotel.

Våra flödesbaserade-vidhäftningsmodeller likna de inledande faserna av leukocytrekrytering från cirkulationen. Förutom leukocyter, kan de användas för att undersöka rekrytering av andra celltyper, såsom terapeutiskt administrerade MSC eller cirkulerande tumörceller. Våra flerskiktade co-kultur-modeller har visat att MSC kommunicerar med endotel att ändra sitt svar på pro-inflammatoriska cytokiner, Altering rekrytering av neutrofiler. Ytterligare forskning med hjälp av sådana modeller krävs för att till fullo förstå hur stromaceller från olika vävnader och villkor (inflammatoriska sjukdomar eller cancer) påverka rekryteringen av leukocyter under inflammation.

Introduction

Inflammation är ett skyddande svar på mikrobiell infektion eller vävnadsskada som kräver tät reglering av leukocyt inträde i och utträde ur den inflammerade vävnaden att tillåta upplösning ^1,2. Överhörning mellan endotelceller (EG) att linje blodkärl, cirkulerande leukocyter och vävnads bosatt stromaceller är avgörande för att samordna denna process ^3. Men okontrollerad rekrytering av leukocyter och deras ineffektiva avslut främja utvecklingen av kroniska inflammatoriska sjukdomar ^4. Vår nuvarande förståelse av leukocytrekrytering i hälsa och sjukdom är ofullständig och mer robusta modeller behövs för att analysera denna process.

De mekanismer som stöder rekryteringen av leukocyter från blod genom kärl EG i postkapillära venoler har väl beskrivits ^1,2,5. Cirkulerande leukocyter fångas av specialiserade receptorer (t.ex. VCAM-1, E-selektin, P-selektin), vilkaär uppreglerat på inflammerat endotel. Dessa transienta interaktioner tillåter leukocyter att interagera med ytan bundna kemokiner och lipid-härledda mediatorer (antingen endotelceller eller stromala ursprung) som aktiverar integriner som uttrycks av leukocyter ^{6- 11.} Detta i sin tur stabiliserar vidhäftning och enheter migration över endotelet och in i vävnaden ^{12- 15.} Inom mjukpapper, rekryterade leukocyter utsätts för stromala-härledda ämnen som påverkar deras rörlighet, funktion och överlevnad ^16,17. Växande bevis tyder starkt på att signaler som tas emot i varje skede av rekryteringsprocessen villkor leukocyter för nästa. Dock kvarstår vår förståelse av leukocytrekrytering ofullständig och mycket lite är känt om komponenter formande leukocyt rörelse inom mjukpapper.

I Birmingham har vi utvecklat flera in vitro "kärl" modeller för att studera rekrytering av leukocyter frånflöde ^9,18,19. Vi förstår nu att vaskulär EG agera som omedelbara regulatorer av leukocytrekrytering reagera på förändringar i sin lokala mikromiljö. Specifikt kan vävnads bosatt stromaceller aktivt reglera det inflammatoriska svaret, delvis av att samtala med grannkärl EG att påverka sin roll i rekryteringen ^3. Vi har tidigare visat att olika stromaceller modulera förmågan hos EG att stödja adhesion och migration av leukocyter i ett vävnadsspecifikt sätt, och att dessa effekter blir förändrad i kroniska sjukdomar ^13,16,20,21. Således stromaceller etablera vävnads "adress-koder" som definierar ramen för varje inflammatoriskt svar ^22. På senare tid har vi visat att benmärg härledd MSC (BMMSC) potent nedreglera svaret från EG till cytokiner, vilket leder till en minskning av rekrytering av både neutrofiler och lymfocyter ^23.

Mekanismerna governing rekrytering klar in vitro har i stor utsträckning använt analyser innehåller en enda celltyp (t.ex. EG) eller protein isolerat. Men dessa studier inte hänsyn till effekterna av den lokala vävnadsmiljön (dvs. förekomst av stromaceller) om rekrytering av leukocyter och deras efterföljande migration in i vävnaden. Här beskriver vi två flödesbaserade metoder där stromaceller, speciellt mesenkymala stamceller (MSC), samar odlade med EG ^23. Sådana modeller tillåter oss att undersöka effekten av stromal cell på endotelceller svar, särskilt deras förmåga att stödja leukocytrekrytering från flödet.

Protocol

1. Isolering och odling av primära humana endotelceller och mesenkymala stamceller Isolering och odling av humana umbilikalvensendotelceller (HUVEC): Sätt navelsträngen på en bricka med hushållspapper och spraya med 70% etanol. Placera i en vävnadskultur huva. Identifiera venen och kanylera i båda ändar. Placera ett buntband runt kanyl änden för att fästa den. Skölj venöst blod med PBS med hjälp av en spruta. Fyll sprutan med luft och passera genom venen för att ta bort och k…

Representative Results

Inledningsvis analyserade vi effekten av att stimulera EG med TNF på rekrytering av neutrofiler från flödet med hjälp av Micromodellen Ibidi (avsnitt 7-9). I frånvaro av TNF, lite om några neutrofiler följs endothelial monolager (Figur 2A). Detta var väntat, eftersom obehandlad / vila EG uttrycker inte de nödvändiga adhesionsmolekyler (selektiner) eller kemokiner att stödja bindande 25,26. I motsats, cytokin-stimulering ökade signifikant neutrofil vidhäftning til…

Discussion

Här beskriver vi två in vitro "kärl" modeller för att studera rekrytering av cirkulerande neutrofiler med inflammerat endotel. En stor fördel med dessa modeller är förmågan att analysera varje steg i leukocytadhesionen kaskad i ordning, som skulle uppträda in vivo. Vi har tidigare observerat en dosberoende ökning av neutrofiladhesion till och själa genom TNF-stimulerad EG ^9,29. Vi beskriver också hur de båda modellerna kan anpassas för att studera effekterna av stroma…

Materials

Collagenase Type Ia	Sigma	C2674	Dilute in 10ml PBS to get a final concentration of 10mg/ml. Store at -20°C in 1ml aliquots.
Dulbecco's PBS	Sigma	D8662	With calcium and magnesium chloride. Keep sterile and store at room temperature.
1X Medium M199	Gibco	31150-022	Warm in 37 °C water bath before use.
Gentamicin sulphate	Sigma	G1397	Store at 4°C. Add to M199 500ml bottle.
Human epidermal growth factor	Sigma	E9644	Store at -20°C in 10µl aliquots.
Fetal calf serum (FCS)	Sigma	F9665	FCS must be batch tested to ensure the growth and viability of isolated EC. Heat inactivate at 56°C. Store in 10ml aliquots at -20°C.
Amphotericin B	Gibco	15290-026	Potent and becomes toxic within a week so fresh complete HUVEC medium must be made up every week. Store at -20°C in 1ml aliquots.
Hydrocortisone	Sigma	H0135	Stock is in ethanol. Store at -20°C in 10µl aliquots.
Collagenase Type II	Sigma	C6885	Dilute stock in PBS to a final concentration of 100mg/ml. Store at -20°C in 100µl aliquots.
Hyaluronidase	Sigma	H3631	Dilute stock in PBS to a final concentration of 20,000U/ml. Store at -20°C in 100µl aliquots.
100µm cell strainer for 50ml centifuge tube	Scientific Lab Supplies (SLS)	352360	Other commercially available cell strainers (e.g. Greiner bio-one) can also be used.
DMEM low glucose	Biosera	LM-D1102/500	Warm in 37 °C water bath before use.
Penicillin/Streptomycin mix	Sigma	P4333	Store at -20°C in 1ml aliquots.
25cm2 tissue culture flask	SLS	353109
75cm2 tissue culture flask	SLS	353136
Bone marrow mesenchymal stem cells vial	Lonza	PT-2501	Store in liquid nitrogen upon arrival. Cells are at passage 2 upon arrival but are designated passage 0. Exapand to passage 3 and store in liquid nitrogen for later use.
Mesenchymal stem cell growth medium (MSCGM)	Lonza	PT-3001	Warm in 37 °C water bath before use. For Cell Tracker Green staining use medium without FCS.
EDTA (0.02%) solution	Sigma	E8008	Store at 4°C. Warm in 37°C water bath before use.
Trypsin solution	Sigma	T4424	Store at -20°C in 2ml aliquots. Thaw at room temperature and use immediately.
Cryovials	Greiner bio-one	2019-02	Keep on ice before adding before adding cell suspension.
Mr. Frosty Freezing Container	Nalgene	5100-0001	Store at room temperature. When adding cryovials with cells store at -80°C for 24h before transfrring cells to liquid nitrogen.
Ibidi u-Slide VI (0.4), T/C treated, sterile	Ibidi	IB-80606	Alternative models include glass capillaries, Cellix Biochips (www.cellixltd.com), BioFlux Plates (www.fluxionbio.com/bioflux/) and GlycoTech parallel plate flow chambers (http://www.glycotech.com/apparatus/parallel.html).
Cell tracker green dye	Life technologies	C2925	Store in 5µl aliquots at -20°C. Dilute in 5ml prewarmed (at 37°C) MSCGM.
Cell counting chambers	Nexcelom	SD-100	Alternatively a haemocytometer can be used.
Cellometer auto T4 cell counter	Nexcelom	Auto T4-203-0238
Tumor necrosis factor α (TNFα)	R&D Systems	210-TA-100	Dilute stock in PBS to a final concentration of 100,000U/ml. Store at -80°C in 10µl aliquots.
6-well, 0.4µm PET Transwell filters	SLS	353090
K2-EDTA in 10ml tubes	Sarstedt		Store at room temperature.
Histopaque 1119	Sigma	11191	Store at 4°C. Warm to room temperature before use.
Histopaque 1077	Sigma	10771	Store at 4°C. Warm to room temperature before use.
10ml round bottomed tube	Appleton Woods	SC211 142 AS
7.5% BSA Fraction V solution	Life technologies	15260-037	Store at 4°C.
20ml Plastipak syringes	BD falcon	300613
5ml Plastipak syringes	BD falcon	302187
2ml Plastipak syringes	BD falcon	300185
3M hypo-allergenic surgical tape 9m x 2.5cm	Micropore	1530-1	Use to secure the syringe tap onto the wall of the perspex chamber.
Silicon rubber tubing, internal diameter/external diameter (ID/OD) of 1/3mm (thin tubing)	Fisher Scientific	FB68854	Cut silicon tubing to the appropriate size. All tubing leading directly to the electronic microvalve must be thin.
Silicon rubber tubing ID/OD of 2/4mm (thick tubing)	Fisher Scientific	FB68855
Portex Blue Line Manometer tubing	Smiths	200/495/200	Tubing leading to the syringe pump.
3-way stopcock	BOC Ohmeda AB
Glass 50ml syringe for pump	Popper Micromate	550962	Must be primed prior to use by removing any air bubbles.
Glass coverslip	Raymond A Lamb		26x76mm coverslips made to order. Lot number 2440980.
Parafilm gasket	American National Can Company		Cut a 26x76mm piece of parafilm using an aluminium template and cut a 20x4mm slot into it using a scalpel 10a. Gasket thickness is approximately 133µm.
Two perspex parallel plates	Wolfson Applied Technology Laboratory		Specially designed chamber consisting of parallel plates held together by 8 screws. The lower plate has a viewing slot cut out in the middle and a shallow recess milled to allow space for the coverslip, filter and gasket. The upper perspex plate has an inlet and outlet hole positioned over the flow channel.
Electronic 3-way microvalve with min. dead space	Lee Products Ltd.	LFYA1226032H	Electronically connected to a 12 volt DC power supply.
Syringe pump for infusion/withdrawal (PHD2000)	Harvard Apparatus	70-2001	Set the diameter to 29mm and refill (flow) rate.
L-shaped connector	Labhut	LE876	To attach to the inlet and outlet ports onto the Ibidi microslide channel.
Video camera	Qimaging	01-QIC-F-M-12-C	Connected to a computer which enables digitall videos to be recorded.
Image-Pro Plus 7.0	Media Cybernetics	41N70000-61592	For data analysis. Manually tag cells displaying the different behaviors. Track cells for analysis of rolling and migration velocities.
			Refer to product datasheets for details on hazards of using the reagents described here.