Förmågan hos inflammerat endotel att rekrytera leukocyter från flödet regleras av mesenkymala stromaceller. Vi beskriver två in vitro-modeller innehåller primära humana celler som kan användas för att bedöma neutrofila rekrytering från flödet och undersöka vilken roll mesenkymala stromaceller spela i regleringen av denna process.
Stromalceller reglerar rekryteringen av cirkulerande leukocyter under inflammation genom överhörning med grann endotelceller. Här beskriver vi två in vitro "kärl" modeller för att studera rekrytering av cirkulerande neutrofiler från flödet av inflammerade endotelceller. En stor fördel med dessa modeller är förmågan att analysera varje steg i leukocytadhesionen kaskad i ordning, som skulle uppträda in vivo. Vi beskriver också hur båda modellerna kan anpassas för att studera rollen av stromaceller, i detta fall mesenkymala stamceller (MSC), i regleringen av leukocytrekrytering.
Primära endotelceller odlades ensamma eller tillsammans med humant MSC i direkt kontakt på Ibidi microslides eller på motsatta sidor av en Transwell-filter under 24 timmar. Kulturer stimulerades med tumömekrosfaktor alfa (TNFa) under 4 h och införlivas i en flödesbaserad vidhäftningsanalys. En bolus av neutrofiler perfunderadesöver endotelet under 4 min. Fångst av flödande neutrofiler och deras interaktioner med endotelet visualiserades genom faskontrastmikroskopi.
I båda modellerna, ökad cytokin-stimulering endothelial rekrytering av flödande neutrofiler i ett dosberoende sätt. Analys av beteendet av rekryterade neutrofiler uppvisade en dosberoende minskning i valsning och en dosberoende ökning av transmigration genom endotelet. I co-kultur, MSC tryckt neutrofiladhesion till TNF-stimulerad endotel.
Våra flödesbaserade-vidhäftningsmodeller likna de inledande faserna av leukocytrekrytering från cirkulationen. Förutom leukocyter, kan de användas för att undersöka rekrytering av andra celltyper, såsom terapeutiskt administrerade MSC eller cirkulerande tumörceller. Våra flerskiktade co-kultur-modeller har visat att MSC kommunicerar med endotel att ändra sitt svar på pro-inflammatoriska cytokiner, Altering rekrytering av neutrofiler. Ytterligare forskning med hjälp av sådana modeller krävs för att till fullo förstå hur stromaceller från olika vävnader och villkor (inflammatoriska sjukdomar eller cancer) påverka rekryteringen av leukocyter under inflammation.
Inflammation är ett skyddande svar på mikrobiell infektion eller vävnadsskada som kräver tät reglering av leukocyt inträde i och utträde ur den inflammerade vävnaden att tillåta upplösning 1,2. Överhörning mellan endotelceller (EG) att linje blodkärl, cirkulerande leukocyter och vävnads bosatt stromaceller är avgörande för att samordna denna process 3. Men okontrollerad rekrytering av leukocyter och deras ineffektiva avslut främja utvecklingen av kroniska inflammatoriska sjukdomar 4. Vår nuvarande förståelse av leukocytrekrytering i hälsa och sjukdom är ofullständig och mer robusta modeller behövs för att analysera denna process.
De mekanismer som stöder rekryteringen av leukocyter från blod genom kärl EG i postkapillära venoler har väl beskrivits 1,2,5. Cirkulerande leukocyter fångas av specialiserade receptorer (t.ex. VCAM-1, E-selektin, P-selektin), vilkaär uppreglerat på inflammerat endotel. Dessa transienta interaktioner tillåter leukocyter att interagera med ytan bundna kemokiner och lipid-härledda mediatorer (antingen endotelceller eller stromala ursprung) som aktiverar integriner som uttrycks av leukocyter 6- 11. Detta i sin tur stabiliserar vidhäftning och enheter migration över endotelet och in i vävnaden 12- 15. Inom mjukpapper, rekryterade leukocyter utsätts för stromala-härledda ämnen som påverkar deras rörlighet, funktion och överlevnad 16,17. Växande bevis tyder starkt på att signaler som tas emot i varje skede av rekryteringsprocessen villkor leukocyter för nästa. Dock kvarstår vår förståelse av leukocytrekrytering ofullständig och mycket lite är känt om komponenter formande leukocyt rörelse inom mjukpapper.
I Birmingham har vi utvecklat flera in vitro "kärl" modeller för att studera rekrytering av leukocyter frånflöde 9,18,19. Vi förstår nu att vaskulär EG agera som omedelbara regulatorer av leukocytrekrytering reagera på förändringar i sin lokala mikromiljö. Specifikt kan vävnads bosatt stromaceller aktivt reglera det inflammatoriska svaret, delvis av att samtala med grannkärl EG att påverka sin roll i rekryteringen 3. Vi har tidigare visat att olika stromaceller modulera förmågan hos EG att stödja adhesion och migration av leukocyter i ett vävnadsspecifikt sätt, och att dessa effekter blir förändrad i kroniska sjukdomar 13,16,20,21. Således stromaceller etablera vävnads "adress-koder" som definierar ramen för varje inflammatoriskt svar 22. På senare tid har vi visat att benmärg härledd MSC (BMMSC) potent nedreglera svaret från EG till cytokiner, vilket leder till en minskning av rekrytering av både neutrofiler och lymfocyter 23.
Mekanismerna governing rekrytering klar in vitro har i stor utsträckning använt analyser innehåller en enda celltyp (t.ex. EG) eller protein isolerat. Men dessa studier inte hänsyn till effekterna av den lokala vävnadsmiljön (dvs. förekomst av stromaceller) om rekrytering av leukocyter och deras efterföljande migration in i vävnaden. Här beskriver vi två flödesbaserade metoder där stromaceller, speciellt mesenkymala stamceller (MSC), samar odlade med EG 23. Sådana modeller tillåter oss att undersöka effekten av stromal cell på endotelceller svar, särskilt deras förmåga att stödja leukocytrekrytering från flödet.
Här beskriver vi två in vitro "kärl" modeller för att studera rekrytering av cirkulerande neutrofiler med inflammerat endotel. En stor fördel med dessa modeller är förmågan att analysera varje steg i leukocytadhesionen kaskad i ordning, som skulle uppträda in vivo. Vi har tidigare observerat en dosberoende ökning av neutrofiladhesion till och själa genom TNF-stimulerad EG 9,29. Vi beskriver också hur de båda modellerna kan anpassas för att studera effekterna av stroma…
The authors have nothing to disclose.
Umbilical cords were collected with the assistance of the Birmingham Women’s Health Care NHS Trust. HMM was supported by an Arthritis Research UK Career Development Fellowship (19899) and Systems Science for Health, University of Birmingham (5212).
Collagenase Type Ia | Sigma | C2674 | Dilute in 10ml PBS to get a final concentration of 10mg/ml. Store at -20°C in 1ml aliquots. |
Dulbecco's PBS | Sigma | D8662 | With calcium and magnesium chloride. Keep sterile and store at room temperature. |
1X Medium M199 | Gibco | 31150-022 | Warm in 37 °C water bath before use. |
Gentamicin sulphate | Sigma | G1397 | Store at 4°C. Add to M199 500ml bottle. |
Human epidermal growth factor | Sigma | E9644 | Store at -20°C in 10µl aliquots. |
Fetal calf serum (FCS) | Sigma | F9665 | FCS must be batch tested to ensure the growth and viability of isolated EC. Heat inactivate at 56°C. Store in 10ml aliquots at -20°C. |
Amphotericin B | Gibco | 15290-026 | Potent and becomes toxic within a week so fresh complete HUVEC medium must be made up every week. Store at -20°C in 1ml aliquots. |
Hydrocortisone | Sigma | H0135 | Stock is in ethanol. Store at -20°C in 10µl aliquots. |
Collagenase Type II | Sigma | C6885 | Dilute stock in PBS to a final concentration of 100mg/ml. Store at -20°C in 100µl aliquots. |
Hyaluronidase | Sigma | H3631 | Dilute stock in PBS to a final concentration of 20,000U/ml. Store at -20°C in 100µl aliquots. |
100µm cell strainer for 50ml centifuge tube | Scientific Lab Supplies (SLS) | 352360 | Other commercially available cell strainers (e.g. Greiner bio-one) can also be used. |
DMEM low glucose | Biosera | LM-D1102/500 | Warm in 37 °C water bath before use. |
Penicillin/Streptomycin mix | Sigma | P4333 | Store at -20°C in 1ml aliquots. |
25cm2 tissue culture flask | SLS | 353109 | |
75cm2 tissue culture flask | SLS | 353136 | |
Bone marrow mesenchymal stem cells vial | Lonza | PT-2501 | Store in liquid nitrogen upon arrival. Cells are at passage 2 upon arrival but are designated passage 0. Exapand to passage 3 and store in liquid nitrogen for later use. |
Mesenchymal stem cell growth medium (MSCGM) | Lonza | PT-3001 | Warm in 37 °C water bath before use. For Cell Tracker Green staining use medium without FCS. |
EDTA (0.02%) solution | Sigma | E8008 | Store at 4°C. Warm in 37°C water bath before use. |
Trypsin solution | Sigma | T4424 | Store at -20°C in 2ml aliquots. Thaw at room temperature and use immediately. |
Cryovials | Greiner bio-one | 2019-02 | Keep on ice before adding before adding cell suspension. |
Mr. Frosty Freezing Container | Nalgene | 5100-0001 | Store at room temperature. When adding cryovials with cells store at -80°C for 24h before transfrring cells to liquid nitrogen. |
Ibidi u-Slide VI (0.4), T/C treated, sterile | Ibidi | IB-80606 | Alternative models include glass capillaries, Cellix Biochips (www.cellixltd.com), BioFlux Plates (www.fluxionbio.com/bioflux/) and GlycoTech parallel plate flow chambers (http://www.glycotech.com/apparatus/parallel.html). |
Cell tracker green dye | Life technologies | C2925 | Store in 5µl aliquots at -20°C. Dilute in 5ml prewarmed (at 37°C) MSCGM. |
Cell counting chambers | Nexcelom | SD-100 | Alternatively a haemocytometer can be used. |
Cellometer auto T4 cell counter | Nexcelom | Auto T4-203-0238 | |
Tumor necrosis factor α (TNFα) | R&D Systems | 210-TA-100 | Dilute stock in PBS to a final concentration of 100,000U/ml. Store at -80°C in 10µl aliquots. |
6-well, 0.4µm PET Transwell filters | SLS | 353090 | |
K2-EDTA in 10ml tubes | Sarstedt | Store at room temperature. | |
Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | Store at 4°C. Warm to room temperature before use. |
Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | Store at 4°C. Warm to room temperature before use. |
10ml round bottomed tube | Appleton Woods | SC211 142 AS | |
7.5% BSA Fraction V solution | Life technologies | 15260-037 | Store at 4°C. |
20ml Plastipak syringes | BD falcon | 300613 | |
5ml Plastipak syringes | BD falcon | 302187 | |
2ml Plastipak syringes | BD falcon | 300185 | |
3M hypo-allergenic surgical tape 9m x 2.5cm | Micropore | 1530-1 | Use to secure the syringe tap onto the wall of the perspex chamber. |
Silicon rubber tubing, internal diameter/external diameter (ID/OD) of 1/3mm (thin tubing) | Fisher Scientific | FB68854 | Cut silicon tubing to the appropriate size. All tubing leading directly to the electronic microvalve must be thin. |
Silicon rubber tubing ID/OD of 2/4mm (thick tubing) | Fisher Scientific | FB68855 | |
Portex Blue Line Manometer tubing | Smiths | 200/495/200 | Tubing leading to the syringe pump. |
3-way stopcock | BOC Ohmeda AB | ||
Glass 50ml syringe for pump | Popper Micromate | 550962 | Must be primed prior to use by removing any air bubbles. |
Glass coverslip | Raymond A Lamb | 26x76mm coverslips made to order. Lot number 2440980. | |
Parafilm gasket | American National Can Company | Cut a 26x76mm piece of parafilm using an aluminium template and cut a 20x4mm slot into it using a scalpel 10a. Gasket thickness is approximately 133µm. | |
Two perspex parallel plates | Wolfson Applied Technology Laboratory | Specially designed chamber consisting of parallel plates held together by 8 screws. The lower plate has a viewing slot cut out in the middle and a shallow recess milled to allow space for the coverslip, filter and gasket. The upper perspex plate has an inlet and outlet hole positioned over the flow channel. | |
Electronic 3-way microvalve with min. dead space | Lee Products Ltd. | LFYA1226032H | Electronically connected to a 12 volt DC power supply. |
Syringe pump for infusion/withdrawal (PHD2000) | Harvard Apparatus | 70-2001 | Set the diameter to 29mm and refill (flow) rate. |
L-shaped connector | Labhut | LE876 | To attach to the inlet and outlet ports onto the Ibidi microslide channel. |
Video camera | Qimaging | 01-QIC-F-M-12-C | Connected to a computer which enables digitall videos to be recorded. |
Image-Pro Plus 7.0 | Media Cybernetics | 41N70000-61592 | For data analysis. Manually tag cells displaying the different behaviors. Track cells for analysis of rolling and migration velocities. |
Refer to product datasheets for details on hazards of using the reagents described here. |