Analyser les effets des cellules stromales sur le recrutement des leucocytes de débit

Summary

La capacité de l'endothélium enflammé de recruter leucocytes du débit est régulé par les cellules stromales mésenchymateuses. Nous décrivons deux modèles in vitro incorporant cellules humaines primaires qui peuvent être utilisés pour évaluer le recrutement des neutrophiles de flux et d'examiner le rôle que les cellules stromales mésenchymateuses jouent dans la régulation de ce processus.

Abstract

Les cellules stromales réglementer le recrutement de leucocytes circulants cours de l'inflammation par la diaphonie avec des cellules endothéliales voisins. Nous décrivons ici deux vitro "vasculaires" modèles pour étudier le recrutement de neutrophiles circulants de flux par les cellules endothéliales enflammées. Un avantage majeur de ces modèles est la capacité d'analyser chaque étape de la cascade d'adhérence des leucocytes dans l'ordre, comme cela se produirait in vivo. Nous décrivons également comment les deux modèles peuvent être adaptés à étudier le rôle des cellules stromales, dans ce cas cellules souches mésenchymateuses (CSM), dans la régulation de recrutement des leucocytes.

Cellules endotheliales primaires ont été cultivées seules ou conjointement avec MSC humain en contact direct sur microplaques Ibidi ou sur des côtés opposés d'un filtre Transwell pendant 24 heures. Les cultures ont été stimulées avec le facteur de nécrose tumorale alpha (TNFa) pendant 4 heures et incorporés dans un essai d'adhérence flow-based. Un bolus de neutrophiles a été perfusésur l'endothélium pendant 4 min. La capture de neutrophiles et de leurs interactions avec l'endothélium fluide a été visualisé par microscopie à contraste de phase.

Dans les deux modèles, les cytokines stimulation augmente le recrutement de neutrophiles endothéliale se écoulant d'une manière dépendante de la dose. L'analyse du comportement des neutrophiles recrutés ont montré une diminution dose-dépendante de roulement et une augmentation dose-dépendante de la transmigration à travers l'endothélium. En co-culture, MSC supprimé l'adhésion des neutrophiles à l'endothélium de TNFa-stimulé.

Nos modèles d'adhésion basés sur le débit imitent les phases initiales de recrutement des leucocytes de la circulation. En plus de leucocytes, ils peuvent être utilisés pour examiner le recrutement d'autres types de cellules, comme les cellules tumorales circulantes MSC ou administrés thérapeutiquement. Notre modèle de co-culture multi-couches ont montré que les MSC communique avec endothélium de modifier leur réponse à des cytokines pro-inflammatoires, Altering le recrutement des neutrophiles. D'autres recherches utilisant ces modèles est nécessaire pour bien comprendre comment les cellules stromales de différents tissus et les conditions (troubles inflammatoires ou de cancer) influencer le recrutement des leucocytes pendant l'inflammation.

Introduction

L'inflammation est une réponse protectrice à une infection microbienne ou d'une blessure de tissu qui nécessite une réglementation stricte de l'entrée de leucocytes et la sortie de l'inflammation des tissus pour permettre la résolution ^1,2. Diaphonie entre les cellules endothéliales (CE) que les vaisseaux sanguins de la ligne, leucocytes circulants et les cellules stromales tissus-résident est essentiel de coordonner ce processus ^3. Cependant, le recrutement incontrôlée de leucocytes et de leur dédouanement inefficaces sous-tendent le développement de maladies inflammatoires chroniques ^4. Notre compréhension actuelle de recrutement des leucocytes dans la santé et la maladie est incomplète et modèles plus robustes sont nécessaires pour analyser ce processus.

Les mécanismes de soutien au recrutement de leucocytes du sang à travers vasculaire CE veinules post-capillaires ont été bien décrits ^1,2,5. Leucocytes circulants sont capturés par des récepteurs spécialisés (par exemple, VCAM-1, E-sélectine, la P-sélectine) quisont régulés à la hausse sur l'endothélium enflammé. Ces interactions transitoires permettent d'interagir avec les leucocytes surface lié chimiokines et médiateurs dérivés de lipides (soit stromales endotheliales ou d'origine) qui activent les intégrines exprimées par les leucocytes ^{6- 11.} Cela stabilise l'adhérence et la migration disques à travers l'endothélium et dans le tissu ^{12 15.} Dans le tissu, recrutés leucocytes sont soumis à des agents stromales dérivées qui influencent leur motilité, la fonction et la survie ^16,17. L'évidence croissante suggère fortement que les signaux reçus à chaque étape des conditions de processus de recrutement des leucocytes pour la prochaine. Cependant, notre compréhension de recrutement des leucocytes reste incomplète et très peu est connu sur le mouvement des leucocytes composants de mise en forme dans le tissu.

A Birmingham, nous avons développé plusieurs in vitro "vasculaires" modèles pour étudier le recrutement de leucocytes^9,18,19 écouler. Nous comprenons maintenant que vasculaire acte CE régulateurs immédiats de recrutement des leucocytes répondre aux changements dans leur micro-environnement local. Plus précisément, les cellules stromales tissus-résident peuvent activement réguler la réponse inflammatoire, en partie en conversant avec vasculaire CE voisine d'influencer leur rôle dans le recrutement ^3. Nous avons précédemment montré que diverses cellules stromales modulent la capacité de CE pour soutenir l'adhérence et la migration des leucocytes d'une manière spécifique d'un tissu, et que ces effets deviennent altérée dans les maladies chroniques ^13,16,20,21. Ainsi, les cellules stromales établissent tissus 'adresse-codes »qui définissent le contexte de chaque réponse inflammatoire ^22. Plus récemment, nous avons démontré que la moelle osseuse provenant MSC (BMMSC) puissamment réguler à la baisse la réponse des CE à des cytokines, conduisant à une réduction dans le recrutement de deux neutrophiles et de lymphocytes ^23.

Les mécanismes GOVrecrutement Erning élucidé in vitro ont largement utilisé les essais comportant un seul type de cellule (par exemple, CE) ou de protéines dans l'isolement. Cependant, ces études ne prennent pas en considération les effets de l'environnement tissulaire locale (ce est à dire, la présence de cellules stromales) sur le recrutement des leucocytes et leur migration ultérieure dans le tissu. Nous décrivons ici deux méthodes basées sur les flux dans lequel les cellules stromales, cellules souches mésenchymateuses spécifiquement (MSC), sont co-cultivées avec des CE ^23. Ces modèles nous permettent d'examiner l'effet des cellules stromales sur les réponses endothéliales, en particulier leur capacité à soutenir le recrutement des leucocytes de l'écoulement.

Protocol

1. Isolement et culture de cellules endothéliales humaines primaires et Cellules souches mésenchymateuses cellules d'isolement et de la culture des droits de l'endothéliales de veine ombilicale (HUVEC): Mettez cordon ombilical sur un plateau avec des serviettes en papier et pulvériser avec 70% d'éthanol. Placez dans une hotte de culture de tissu. Identifier la veine et Cathétériser aux deux extrémités. Placez une attache de câble autour de l'extrémité canule pour le fixer….

Representative Results

Initialement, nous avons analysé l'effet de stimuler la CE avec du TNFa sur le recrutement de neutrophiles de flux en utilisant le modèle de microplaque Ibidi (article 7-9). En l'absence de TNFa, peu ou pas de neutrophiles ont adhéré à la monocouche endotheliale (figure 2A). Ceci a été prévu, en tant que non traité / CE repos ne expriment pas les molécules d'adhérence nécessaires (les sélectines) ou à l'appui de liaison de chimiokines 25,26. En r…

Discussion

Nous décrivons ici deux vitro "vasculaires" modèles pour étudier le recrutement de neutrophiles circulants par l'endothélium enflammé. Un avantage majeur de ces modèles est la capacité d'analyser chaque étape de la cascade d'adhérence des leucocytes dans l'ordre, comme cela se produirait in vivo. Nous avons déjà observé une augmentation dose-dépendante de l'adhésion des neutrophiles à travers transmigration et stimulée par le TNFa CE ^9,29.</su…

Materials

Collagenase Type Ia	Sigma	C2674	Dilute in 10ml PBS to get a final concentration of 10mg/ml. Store at -20°C in 1ml aliquots.
Dulbecco's PBS	Sigma	D8662	With calcium and magnesium chloride. Keep sterile and store at room temperature.
1X Medium M199	Gibco	31150-022	Warm in 37 °C water bath before use.
Gentamicin sulphate	Sigma	G1397	Store at 4°C. Add to M199 500ml bottle.
Human epidermal growth factor	Sigma	E9644	Store at -20°C in 10µl aliquots.
Fetal calf serum (FCS)	Sigma	F9665	FCS must be batch tested to ensure the growth and viability of isolated EC. Heat inactivate at 56°C. Store in 10ml aliquots at -20°C.
Amphotericin B	Gibco	15290-026	Potent and becomes toxic within a week so fresh complete HUVEC medium must be made up every week. Store at -20°C in 1ml aliquots.
Hydrocortisone	Sigma	H0135	Stock is in ethanol. Store at -20°C in 10µl aliquots.
Collagenase Type II	Sigma	C6885	Dilute stock in PBS to a final concentration of 100mg/ml. Store at -20°C in 100µl aliquots.
Hyaluronidase	Sigma	H3631	Dilute stock in PBS to a final concentration of 20,000U/ml. Store at -20°C in 100µl aliquots.
100µm cell strainer for 50ml centifuge tube	Scientific Lab Supplies (SLS)	352360	Other commercially available cell strainers (e.g. Greiner bio-one) can also be used.
DMEM low glucose	Biosera	LM-D1102/500	Warm in 37 °C water bath before use.
Penicillin/Streptomycin mix	Sigma	P4333	Store at -20°C in 1ml aliquots.
25cm2 tissue culture flask	SLS	353109
75cm2 tissue culture flask	SLS	353136
Bone marrow mesenchymal stem cells vial	Lonza	PT-2501	Store in liquid nitrogen upon arrival. Cells are at passage 2 upon arrival but are designated passage 0. Exapand to passage 3 and store in liquid nitrogen for later use.
Mesenchymal stem cell growth medium (MSCGM)	Lonza	PT-3001	Warm in 37 °C water bath before use. For Cell Tracker Green staining use medium without FCS.
EDTA (0.02%) solution	Sigma	E8008	Store at 4°C. Warm in 37°C water bath before use.
Trypsin solution	Sigma	T4424	Store at -20°C in 2ml aliquots. Thaw at room temperature and use immediately.
Cryovials	Greiner bio-one	2019-02	Keep on ice before adding before adding cell suspension.
Mr. Frosty Freezing Container	Nalgene	5100-0001	Store at room temperature. When adding cryovials with cells store at -80°C for 24h before transfrring cells to liquid nitrogen.
Ibidi u-Slide VI (0.4), T/C treated, sterile	Ibidi	IB-80606	Alternative models include glass capillaries, Cellix Biochips (www.cellixltd.com), BioFlux Plates (www.fluxionbio.com/bioflux/) and GlycoTech parallel plate flow chambers (http://www.glycotech.com/apparatus/parallel.html).
Cell tracker green dye	Life technologies	C2925	Store in 5µl aliquots at -20°C. Dilute in 5ml prewarmed (at 37°C) MSCGM.
Cell counting chambers	Nexcelom	SD-100	Alternatively a haemocytometer can be used.
Cellometer auto T4 cell counter	Nexcelom	Auto T4-203-0238
Tumor necrosis factor α (TNFα)	R&D Systems	210-TA-100	Dilute stock in PBS to a final concentration of 100,000U/ml. Store at -80°C in 10µl aliquots.
6-well, 0.4µm PET Transwell filters	SLS	353090
K2-EDTA in 10ml tubes	Sarstedt		Store at room temperature.
Histopaque 1119	Sigma	11191	Store at 4°C. Warm to room temperature before use.
Histopaque 1077	Sigma	10771	Store at 4°C. Warm to room temperature before use.
10ml round bottomed tube	Appleton Woods	SC211 142 AS
7.5% BSA Fraction V solution	Life technologies	15260-037	Store at 4°C.
20ml Plastipak syringes	BD falcon	300613
5ml Plastipak syringes	BD falcon	302187
2ml Plastipak syringes	BD falcon	300185
3M hypo-allergenic surgical tape 9m x 2.5cm	Micropore	1530-1	Use to secure the syringe tap onto the wall of the perspex chamber.
Silicon rubber tubing, internal diameter/external diameter (ID/OD) of 1/3mm (thin tubing)	Fisher Scientific	FB68854	Cut silicon tubing to the appropriate size. All tubing leading directly to the electronic microvalve must be thin.
Silicon rubber tubing ID/OD of 2/4mm (thick tubing)	Fisher Scientific	FB68855
Portex Blue Line Manometer tubing	Smiths	200/495/200	Tubing leading to the syringe pump.
3-way stopcock	BOC Ohmeda AB
Glass 50ml syringe for pump	Popper Micromate	550962	Must be primed prior to use by removing any air bubbles.
Glass coverslip	Raymond A Lamb		26x76mm coverslips made to order. Lot number 2440980.
Parafilm gasket	American National Can Company		Cut a 26x76mm piece of parafilm using an aluminium template and cut a 20x4mm slot into it using a scalpel 10a. Gasket thickness is approximately 133µm.
Two perspex parallel plates	Wolfson Applied Technology Laboratory		Specially designed chamber consisting of parallel plates held together by 8 screws. The lower plate has a viewing slot cut out in the middle and a shallow recess milled to allow space for the coverslip, filter and gasket. The upper perspex plate has an inlet and outlet hole positioned over the flow channel.
Electronic 3-way microvalve with min. dead space	Lee Products Ltd.	LFYA1226032H	Electronically connected to a 12 volt DC power supply.
Syringe pump for infusion/withdrawal (PHD2000)	Harvard Apparatus	70-2001	Set the diameter to 29mm and refill (flow) rate.
L-shaped connector	Labhut	LE876	To attach to the inlet and outlet ports onto the Ibidi microslide channel.
Video camera	Qimaging	01-QIC-F-M-12-C	Connected to a computer which enables digitall videos to be recorded.
Image-Pro Plus 7.0	Media Cybernetics	41N70000-61592	For data analysis. Manually tag cells displaying the different behaviors. Track cells for analysis of rolling and migration velocities.
			Refer to product datasheets for details on hazards of using the reagents described here.