Анализ влияния стромальных клеток на вербовкой лейкоцитов из потока
Summary
Способность воспаленной эндотелия на работу лейкоцитов из потока регулируется мезенхимальных стромальных клеток. Мы описываем две модели в пробирке, включающие первичные человеческие клетки, которые могут быть использованы для оценки набора нейтрофилов из потока и изучить роль, которую мезенхимальных стромальных клеток играть в регулировании этого процесса.
Abstract
Стромальных клеток регулировать набор циркулирующих лейкоцитов при воспалении через кросс-разговоры с соседними эндотелиальных клеток. Здесь мы опишем два в пробирке моделей "сосудистых" для изучения набора циркулирующих нейтрофилов из потока воспаленной эндотелиальных клеток. Основным преимуществом этих моделей является возможность анализировать каждый шаг в каскаде адгезии лейкоцитов в порядке, как имело бы место в естественных условиях. Мы также описать, как обе модели могут быть адаптированы для изучения роли стромальных клеток, в данном случае мезенхимальных стволовых клеток (МСК), в регулировании набора лейкоцитов.
Первичные эндотелиальные клетки культивировали отдельно или вместе с человеческой MSC в непосредственном контакте на Ibidi microslides или на противоположных сторонах фильтра Transwell в течение 24 ч. Культуры стимулировали фактора некроза опухолей альфа (ФНО) в течение 4 ч и включены в поток на основе анализа адгезии. Болюс нейтрофилов перфузиина эндотелии в течение 4 мин. Захват течет нейтрофилов и их взаимодействия с эндотелия визуализировали фазово-контрастной микроскопии.
В обеих моделях, цитокин-стимуляция увеличилось эндотелия набор протекающих нейтрофилов в зависимости от дозы. Анализ поведения завербованных нейтрофилов показал дозозависимое снижение в прокатных и дозозависимое увеличение в переселении через эндотелий. В совместной культуре, MSC подавляется адгезию нейтрофилов к ФНО-стимулированной эндотелия.
Наши модели, основанные спаек потока имитировать начальные фазы набора лейкоцитов из обращения. В дополнение к лейкоцитов, они могут быть использованы для изучения набора других типов клеток, таких как административные терапевтически MSC или циркулирующих опухолевых клеток. Наши многослойные модели Сотрудничество культуры показали, что MSC общаться с эндотелием, чтобы изменить свой ответ на про-воспалительных цитокинов, Alteriнг вербовку нейтрофилов. Дальнейшие исследования с использованием таких моделей требуется, чтобы полностью понять, как стромальных клеток из различных тканей и условий (воспалительных заболеваний или рака) влиять на вербовку лейкоцитов при воспалении.
Introduction
Воспаление является защитной реакцией на микробной инфекции или повреждения ткани, что требует ужесточения регулирования въезда лейкоцитов в и выход из воспаленной ткани, чтобы разрешение 1,2. Перекрестные помехи между эндотелиальных клеток (ЭК), которые выравнивают кровеносные сосуды, циркулирующих лейкоцитов и тканевых резидентом стромальных клеток имеет важное значение для координации этого процесса 3. Однако, неконтролируемый набор лейкоцитов и их неэффективными оформление лежат в основе развития хронических воспалительных заболеваний 4. Наша нынешняя понимание набора лейкоцитов в норме и патологии является неполным и более надежные модели необходимы для анализа этого процесса.
Механизмы, поддерживающие набор лейкоцитов из крови через сосудистую ЕС в пост венул были хорошо описаны 1,2,5. Циркулирующие лейкоциты захватываются специализированных рецепторов (например, VCAM-1, Е-селектина, Р-селектина), которыйповышается, на воспаленную эндотелия. Эти переходные взаимодействия позволяют лейкоциты взаимодействовать с поверхностными связаны хемокинов и липидов, полученных посредников (как эндотелиальных или стромальных происхождения), которые активируют интегрины, выраженные лейкоцитов 6- 11. Это, в свою очередь, стабилизирует адгезию и диски миграции через эндотелий и в ткани 12-15. В ткани, набранных лейкоциты подвергаются агентов стромальных происхождения, которые влияют на их подвижность, функции и выживания 16,17. Появляется все больше свидетельств наводит на мысль, что сигналы, полученные на каждом этапе в условиях процесса набора лейкоцитов для следующей. Тем не менее, наше понимание набора лейкоцитов остается неполным и очень мало известно о компонентах формования движения лейкоцитов в ткани.
В Бирмингеме мы разработали несколько в пробирке моделей "сосудистых", чтобы изучить набор лейкоцитов оттечь 9,18,19. Теперь мы понимаем, что сосудистые акт ЕС как непосредственные регуляторы набора лейкоцитов реагировать на изменения в их микроокружения. В частности, ткань резидентом стромальные клетки могут активно регулировать воспалительный ответ, в части, беседуя с соседней сосудистой ЕС повлиять на их роль в вербовке 3. Ранее мы показали, что различные стромальные клетки модулировать способность ЕС для поддержки адгезию и миграцию лейкоцитов в ткани-специфическим образом, и что эти эффекты становятся изменены хронических заболеваний 13,16,20,21. Таким образом, клетки стромы установить тканей "Адрес-коды", которые определяют контекст каждого воспалительной реакции 22. Совсем недавно мы показали, что костный мозг происходит MSC (BMMSC) мощно вниз регулировать реакцию ЕС на цитокины, что приводит к снижению в наборе обоих нейтрофилов и лимфоцитов 23.
Механизмы гос, регламентирующими набор освещены в пробирке в основном используется анализов, включающих один тип клеток (например, ЕС) или белок в изоляции. Тем не менее, эти исследования не принимать во внимание последствия локального окружения ткани (то есть, наличие стромальных клеток) о вербовке лейкоцитов и их последующая миграция в ткани. Здесь мы опишем два метода на основе потока, в котором клетки стромы, в частности, мезенхимальные стволовые клетки (МСК), являются совместном культивировании с ЕС 23. Такие модели позволяют исследовать влияние стромы ячейки на эндотелиальные ответов, в частности, их способности поддерживать набор лейкоцитов из потока.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы опишем два в пробирке моделей "сосудистых" для изучения набора циркулирующих нейтрофилов воспаленной эндотелия. Основным преимуществом этих моделей является возможность анализировать каждый шаг в каскаде адгезии лейкоцитов в порядке, как имело бы место в естест?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Umbilical cords were collected with the assistance of the Birmingham Women’s Health Care NHS Trust. HMM was supported by an Arthritis Research UK Career Development Fellowship (19899) and Systems Science for Health, University of Birmingham (5212).
Materials
| Collagenase Type Ia | Sigma | C2674 | Dilute in 10ml PBS to get a final concentration of 10mg/ml. Store at -20°C in 1ml aliquots. |
| Dulbecco's PBS | Sigma | D8662 | With calcium and magnesium chloride. Keep sterile and store at room temperature. |
| 1X Medium M199 | Gibco | 31150-022 | Warm in 37 °C water bath before use. |
| Gentamicin sulphate | Sigma | G1397 | Store at 4°C. Add to M199 500ml bottle. |
| Human epidermal growth factor | Sigma | E9644 | Store at -20°C in 10µl aliquots. |
| Fetal calf serum (FCS) | Sigma | F9665 | FCS must be batch tested to ensure the growth and viability of isolated EC. Heat inactivate at 56°C. Store in 10ml aliquots at -20°C. |
| Amphotericin B | Gibco | 15290-026 | Potent and becomes toxic within a week so fresh complete HUVEC medium must be made up every week. Store at -20°C in 1ml aliquots. |
| Hydrocortisone | Sigma | H0135 | Stock is in ethanol. Store at -20°C in 10µl aliquots. |
| Collagenase Type II | Sigma | C6885 | Dilute stock in PBS to a final concentration of 100mg/ml. Store at -20°C in 100µl aliquots. |
| Hyaluronidase | Sigma | H3631 | Dilute stock in PBS to a final concentration of 20,000U/ml. Store at -20°C in 100µl aliquots. |
| 100µm cell strainer for 50ml centifuge tube | Scientific Lab Supplies (SLS) | 352360 | Other commercially available cell strainers (e.g. Greiner bio-one) can also be used. |
| DMEM low glucose | Biosera | LM-D1102/500 | Warm in 37 °C water bath before use. |
| Penicillin/Streptomycin mix | Sigma | P4333 | Store at -20°C in 1ml aliquots. |
| 25cm2 tissue culture flask | SLS | 353109 | |
| 75cm2 tissue culture flask | SLS | 353136 | |
| Bone marrow mesenchymal stem cells vial | Lonza | PT-2501 | Store in liquid nitrogen upon arrival. Cells are at passage 2 upon arrival but are designated passage 0. Exapand to passage 3 and store in liquid nitrogen for later use. |
| Mesenchymal stem cell growth medium (MSCGM) | Lonza | PT-3001 | Warm in 37 °C water bath before use. For Cell Tracker Green staining use medium without FCS. |
| EDTA (0.02%) solution | Sigma | E8008 | Store at 4°C. Warm in 37°C water bath before use. |
| Trypsin solution | Sigma | T4424 | Store at -20°C in 2ml aliquots. Thaw at room temperature and use immediately. |
| Cryovials | Greiner bio-one | 2019-02 | Keep on ice before adding before adding cell suspension. |
| Mr. Frosty Freezing Container | Nalgene | 5100-0001 | Store at room temperature. When adding cryovials with cells store at -80°C for 24h before transfrring cells to liquid nitrogen. |
| Ibidi u-Slide VI (0.4), T/C treated, sterile | Ibidi | IB-80606 | Alternative models include glass capillaries, Cellix Biochips (www.cellixltd.com), BioFlux Plates (www.fluxionbio.com/bioflux/) and GlycoTech parallel plate flow chambers (http://www.glycotech.com/apparatus/parallel.html). |
| Cell tracker green dye | Life technologies | C2925 | Store in 5µl aliquots at -20°C. Dilute in 5ml prewarmed (at 37°C) MSCGM. |
| Cell counting chambers | Nexcelom | SD-100 | Alternatively a haemocytometer can be used. |
| Cellometer auto T4 cell counter | Nexcelom | Auto T4-203-0238 | |
| Tumor necrosis factor α (TNFα) | R&D Systems | 210-TA-100 | Dilute stock in PBS to a final concentration of 100,000U/ml. Store at -80°C in 10µl aliquots. |
| 6-well, 0.4µm PET Transwell filters | SLS | 353090 | |
| K2-EDTA in 10ml tubes | Sarstedt | Store at room temperature. | |
| Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | Store at 4°C. Warm to room temperature before use. |
| Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | Store at 4°C. Warm to room temperature before use. |
| 10ml round bottomed tube | Appleton Woods | SC211 142 AS | |
| 7.5% BSA Fraction V solution | Life technologies | 15260-037 | Store at 4°C. |
| 20ml Plastipak syringes | BD falcon | 300613 | |
| 5ml Plastipak syringes | BD falcon | 302187 | |
| 2ml Plastipak syringes | BD falcon | 300185 | |
| 3M hypo-allergenic surgical tape 9m x 2.5cm | Micropore | 1530-1 | Use to secure the syringe tap onto the wall of the perspex chamber. |
| Silicon rubber tubing, internal diameter/external diameter (ID/OD) of 1/3mm (thin tubing) | Fisher Scientific | FB68854 | Cut silicon tubing to the appropriate size. All tubing leading directly to the electronic microvalve must be thin. |
| Silicon rubber tubing ID/OD of 2/4mm (thick tubing) | Fisher Scientific | FB68855 | |
| Portex Blue Line Manometer tubing | Smiths | 200/495/200 | Tubing leading to the syringe pump. |
| 3-way stopcock | BOC Ohmeda AB | ||
| Glass 50ml syringe for pump | Popper Micromate | 550962 | Must be primed prior to use by removing any air bubbles. |
| Glass coverslip | Raymond A Lamb | 26x76mm coverslips made to order. Lot number 2440980. | |
| Parafilm gasket | American National Can Company | Cut a 26x76mm piece of parafilm using an aluminium template and cut a 20x4mm slot into it using a scalpel 10a. Gasket thickness is approximately 133µm. | |
| Two perspex parallel plates | Wolfson Applied Technology Laboratory | Specially designed chamber consisting of parallel plates held together by 8 screws. The lower plate has a viewing slot cut out in the middle and a shallow recess milled to allow space for the coverslip, filter and gasket. The upper perspex plate has an inlet and outlet hole positioned over the flow channel. | |
| Electronic 3-way microvalve with min. dead space | Lee Products Ltd. | LFYA1226032H | Electronically connected to a 12 volt DC power supply. |
| Syringe pump for infusion/withdrawal (PHD2000) | Harvard Apparatus | 70-2001 | Set the diameter to 29mm and refill (flow) rate. |
| L-shaped connector | Labhut | LE876 | To attach to the inlet and outlet ports onto the Ibidi microslide channel. |
| Video camera | Qimaging | 01-QIC-F-M-12-C | Connected to a computer which enables digitall videos to be recorded. |
| Image-Pro Plus 7.0 | Media Cybernetics | 41N70000-61592 | For data analysis. Manually tag cells displaying the different behaviors. Track cells for analysis of rolling and migration velocities. |
| Refer to product datasheets for details on hazards of using the reagents described here. |
References
- Springer, T. A. Traffic signals on endothelium for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration. Ann. Rev. Physiol. 57, 827-872 (1995).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
- McGettrick, H. M., Butler, L. M., Buckley, C. D., Rainger, G. E., Nash, G. B. Tissue stroma as a regulator of leukocyte recruitment in inflammation. Journal of leukocyte biology. 91 (3), 385-400 (2012).
- Serhan, C. N., Savill, J. Resolution of inflammation: the beginning programs the end. Nature immunology. 6 (12), 1191-1197 (2005).
- Schmidt, S., Moser, M., Sperandio, M. The molecular basis of leukocyte recruitment and its deficiencies. Molecular immunology. 55, 49-58 (2013).
- Luu, N. T., Rainger, G. E., Nash, G. B. Differential Ability of Exogenous Chemotactic Agents to Disrupt Transendothelial Migration of Flowing Neutrophils. The Journal of Immunology. 164 (11), 5961-5969 (2000).
- Smith, C. W., Rothlein, R., et al. Recognition of an endothelial determinant for CD 18-dependent human neutrophil adherence and transendothelial migration. The Journal of clinical investigation. 82 (5), 1745-1756 (1988).
- Luscinskas, F. W., Brock, A. F., Arnaout, M. A., Gimbrone, M. A. Endothelial-leukocyte adhesion molecule-1-dependent and leukocyte (CD11/CD18)-dependent mechanisms contribute to polymorphonuclear leukocyte adhesion to cytokine-activated human vascular endothelium. J. Immunol. 142 (7), (1989).
- Bahra, P., Rainger, G. E., Wautier, J. L., Nguyet-Thin, L., Nash, G. B. Each step during transendothelial migration of flowing neutrophils is regulated by the stimulatory concentration of tumour necrosis factor-alpha. Cell adhesion and communication. 6 (6), 491-501 (1998).
- Piali, L., Weber, C., et al. The chemokine receptor CXCR3 mediates rapid and shear-resistant adhesion-induction of effector T lymphocytes by the chemokines IP10 and Mig. European journal of immunology. 28 (3), 961-972 (1998).
- McGettrick, H. M., Smith, E., et al. Fibroblasts from different sites may promote or inhibit recruitment of flowing lymphocytes by endothelial cells. European journal of immunology. 39 (1), 113-125 (2009).
- McGettrick, H. M., Hunter, K., Moss, P. a., Buckley, C. D., Rainger, G. E., Nash, G. B. Direct observations of the kinetics of migrating T cells suggest active retention by endothelial cells with continual bidirectional migration. Journal of leukocyte biology. 85 (1), 98-107 (2009).
- McGettrick, H. M., Buckley, C. D., Filer, A., Rainger, G. E., Nash, G. B. Stromal cells differentially regulate neutrophil and lymphocyte recruitment through the endothelium. Immunology. 131 (3), 357-370 (2010).
- Tull, S. P., Yates, C. M., et al. Omega-3 Fatty acids and inflammation: novel interactions reveal a new step in neutrophil recruitment. PLoS biology. 7 (8), e1000177 (2009).
- Ahmed, S. R., McGettrick, H. M. Prostaglandin D2 regulates CD4+ memory T cell trafficking across blood vascular endothelium and primes these cells for clearance across lymphatic endothelium. Journal of immunology. 187 (3), 1432-1439 (2011).
- Bradfield, P. F., Amft, N., et al. Rheumatoid fibroblast-like synoviocytes overexpress the chemokine stromal cell-derived factor 1 (CXCL12), which supports distinct patterns and rates of CD4+ and CD8+ T cell migration within synovial tissue. Arthritis and rheumatism. 48 (9), 2472-2482 (2003).
- Filer, A., Parsonage, G., et al. Differential survival of leukocyte subsets mediated by synovial, bone marrow, and skin fibroblasts: site-specific versus activation-dependent survival of T cells and neutrophils. Arthritis and rheumatism. 54 (7), 2096-2108 (2006).
- Lally, F., Smith, E., et al. A novel mechanism of neutrophil recruitment in a coculture model of the rheumatoid synovium. Arthritis and rheumatism. 52 (11), 3460-3490 (2005).
- Chakravorty, S. J., McGettrick, H. M., Butler, L. M., Buckley, C. D., Rainger, G. E., Nash, G. B. An in vitro. model for analysing neutrophil migration into and away from the sub-endothelial space: Roles of flow and CD31. Biorheology. 43 (1), 71-82 (2006).
- Rainger, G. E., Nash, G. B. Cellular Pathology of Atherosclerosis Smooth Muscle Cells Prime Cocultured Endothelial Cells for Enhanced Leukocyte Adhesion. Circulation Research. 88 (6), 615-622 (2001).
- Kuravi, S. J., McGettrick, H. M. Podocytes regulate neutrophil recruitment by glomerular endothelial cells via IL-6-mediated crosstalk. Journal of immunology. 193 (1), 234-243 (2004).
- Parsonage, G., Filer, A. D. A stromal address code defined by fibroblasts. Trends in immunology. 26 (3), 150-156 (2005).
- Luu, N. T., McGettrick, H. M. Crosstalk between mesenchymal stem cells and endothelial cells leads to downregulation of cytokine-induced leukocyte recruitment. Stem cells. 31 (12), 2690-2702 (2013).
- Bevilacqua, M. P., Nelson, R. M., Mannori, G., Cecconi, O. Endothelial-leukocyte adhesion molecules in human disease. Annual review of medicine. 45, 361-378 (1994).
- Stanness, K. A., Beatty, P. G., Ochs, H. D., Harlan, J. M. An endothelial cell surface factor(s) induced in vitro. 136 (12), 4548-4553 (1986).
- Burton, V. J., Butler, L. M. Delay of migrating leukocytes by the basement membrane deposited by endothelial cells in long-term culture. Experimental cell research. 317 (3), 276-292 (2011).
- Luu, N. T., Rainger, G. E., Buckley, C. D., Nash, G. B. CD31 Regulates Direction and Rate of Neutrophil Migration over and under Endothelial Cells. Journal of Vascular Research. 40 (5), 467-479 (2003).
- McGettrick, H. M., Buckley, C. D., Ed Rainger, G., Nash, G. B. Influence of stromal cells on lymphocyte adhesion and migration on endothelial cells. Methods in molecular biology. 616, 49-68 (2010).
- Butler, L. M., McGettrick, H. M., Nash, G. B. Static and dynamic assays of cell adhesion relevant to the vasculature. Methods in molecular biology. 467, 211-228 (2009).
- Jeffery, H. C., Buckley, C. D., Moss, P., Rainger, G. E., Nash, G. B., McGettrick, H. M. Analysis of the effects of stromal cells on the migration of lymphocytes into and through inflamed tissue using 3-D culture models. Journal of immunological methods. 400-401, 45-57 (2013).
