Análise dos efeitos de células estromais no recrutamento de leucócitos de Fluxo

Summary

A capacidade do endotélio inflamado para recrutar leucócitos do fluxo é regulado por células estromais mesenquimais. Descrevemos dois modelos in vitro que incorporam as células humanas primárias que podem ser utilizadas para avaliar o recrutamento de neutrófilos a partir do caudal e examinar o papel que as células estromais mesenquimatosas jogar na regulação neste processo.

Abstract

As células estromais regular o recrutamento de leucócitos circulantes durante a inflamação através de cross-talk com células endoteliais vizinhas. Aqui nós descrevemos dois modelos in vitro "vasculares" para estudar o recrutamento de neutrófilos circulantes de fluxo pelas células endoteliais inflamadas. Uma grande vantagem destes modelos é a capacidade de analisar cada passo na cascata de adesão de leucócitos no fim, como poderia ocorrer in vivo. Descrevemos também como ambos os modelos podem ser adaptados para estudar o papel das células estromais, neste caso as células estaminais mesenquimais (MSC), em regular o recrutamento de leucócitos.

Células endoteliais primárias foram cultivadas isoladamente ou em conjunto com MSC humana em contacto directo em microslides Ibidi ou em lados opostos de um filtro Transwell durante 24 h. As culturas foram estimuladas com factor de necrose tumoral alfa (TNFa) durante 4 horas e incorporadas num ensaio de adesão com base em fluxo. Um bolus de neutrófilos foi perfundidoao longo do endotélio, durante 4 min. A captura de fluir neutrófilos e suas interações com o endotélio foi visualizado por microscopia de contraste de fase.

Em ambos os modelos, a estimulação de citoquinas-endotelial aumento do recrutamento de neutrófilos fluindo de uma maneira dependente da dose. A análise do comportamento dos neutrófilos recrutados mostraram um decréscimo dependente da dose no rolamento e um aumento dependente da dose na transmigração através do endotélio. Em co-cultura, MSC suprimida adesão de neutrófilos ao endotélio estimulada-TNF.

Os nossos modelos baseados na aderência de fluxo de imitar as fases iniciais do recrutamento de leucócitos da circulação. Além de leucócitos, que pode ser usado para examinar o recrutamento de outros tipos de células, tais como células tumorais circulantes ou MSC administrados terapeuticamente. Os nossos modelos de multi-camadas de co-cultura MSC demonstraram que comunicam com endotélio para modificar a sua resposta a citocinas pró-inflamatórias, Altering o recrutamento de neutrófilos. Mais pesquisas utilizando esses modelos é necessário para entender completamente como células estromais de diferentes tecidos e condições (doenças inflamatórias ou câncer) influenciam o recrutamento de leucócitos durante a inflamação.

Introduction

A inflamação é uma resposta protectora contra a infecção microbiana ou lesão do tecido que requer regulação apertada de entrada e saída de leucócitos a partir do tecido inflamado para permitir a resolução ^{de 1,2.} Conversa cruzada entre as células endoteliais (CE) que os navios de linha de sangue, leucócitos circulantes e células do estroma do tecido residente é essencial para coordenar este processo ^3. No entanto, o recrutamento descontrolada de leucócitos e sua desobstrução ineficaz de apoiar o desenvolvimento de doenças inflamatórias crônicas ^4. A nossa compreensão atual de recrutamento de leucócitos na saúde e na doença é incompleta e modelos mais robustos são necessários para analisar este processo.

Os mecanismos de apoio ao recrutamento de leucócitos do sangue por meio CE vascular em vênulas pós-capilares foram bem descritas ^1,2,5. Leucócitos circulantes são capturados por receptores especializados (por exemplo, VCAM-1, E-selectina, P-selectina) quesão-regulada no endotélio inflamado. Essas interações transientes permitir leucócitos para interagir com a superfície vinculado quimiocinas e mediadores derivados de lipídeos (ou endoteliais ou estromais na origem) que ativam integrinas expressas pelos leucócitos ^{6- 11.} Este, por sua vez estabiliza adesão e migração unidades através do endotélio e no tecido ^{12- 15.} Dentro do tecido, os leucócitos são recrutados sujeitos a agentes derivados de estroma que influenciam a motilidade, função e sobrevivência ^16,17. Evidências crescentes sugerem fortemente que os sinais recebidos em cada etapa das condições do processo de recrutamento de leucócitos para a próxima. No entanto, a nossa compreensão do recrutamento de leucócitos permanece incompleta e muito pouco se sabe sobre o movimento de leucócitos componentes formação dentro do tecido.

Em Birmingham, temos desenvolvido vários modelos in vitro "vasculares" para estudar o recrutamento de leucócitos a partir defluir ^9,18,19. Agora entendemos que atuam CE vascular reguladores como imediatos de recrutamento de leucócitos de responder às mudanças em seu microambiente local. Especificamente, as células do estroma do tecido residente pode regular ativamente a resposta inflamatória, em parte, conversando com a vizinha CE vascular para influenciar o seu papel no recrutamento ^3. Mostrámos previamente que várias células do estroma modular a capacidade da EC para suportar a adesão e migração de leucócitos de uma forma específica do tecido, e que estes efeitos são alteradas em doenças crónicas ^13,16,20,21. Assim, as células do estroma estabelecer tecido 'Endereço-códigos "que definem o contexto de cada resposta inflamatória ^22. Mais recentemente, têm demonstrado que o MSC de medula óssea derivada (BMMSC) potentemente a infra-regular a resposta de CE de citocinas, que conduz a uma redução no recrutamento dos neutrófilos e linfócitos ^23.

Os mecanismos govlando recrutamento elucidados in vitro foram amplamente utilizados ensaios incorporando um único tipo de células (por exemplo, EC) ou proteína de forma isolada. No entanto, estes estudos não levam em consideração os efeitos do ambiente local do tecido (isto é, a presença de células estromais) sobre o recrutamento de leucócitos e a sua subsequente migração para o tecido. Aqui nós descrevemos dois métodos baseadas no fluxo em que as células do estroma, especificamente as células-tronco mesenquimais (MSC), são co-cultivadas com EC ^23. Esses modelos permitem-nos examinar o efeito de células do estroma em respostas endoteliais, em particular a sua capacidade de apoiar o recrutamento de leucócitos de fluxo.

Protocol

1. Isolamento e cultura de células endoteliais humanas primárias e Células-Tronco Mesenquimais Células isolamento e cultivo de humanos umbilical endoteliais veia (HUVEC): Coloque cordão umbilical num tabuleiro com toalhas de papel e pulverizar com etanol a 70%. Coloque em uma capa de cultura de tecidos. Identificar a veia e canular em ambas as extremidades. Coloque uma braçadeira em torno do fim canulada para prendê-lo. Lave a sangue venoso com PBS usando uma seringa. Encha a seringa…

Representative Results

Inicialmente, analisamos o efeito de estimular CE com TNF sobre o recrutamento de neutrófilos de fluxo, utilizando o modelo microlâmina Ibidi (Seção 7-9). Na ausência de TNF, pouco se qualquer neutrófilos aderida à monocamada endotelial (Figura 2A). Isto era esperado, como não tratada / descansando CE não expressam as moléculas necessárias adesão (selectinas) ou quimiocinas para apoiar obrigatório 25,26. Em contraste, a estimulação de citoquinas-aumentou signif…

Discussion

Aqui nós descrevemos dois modelos in vitro "vasculares" para estudar o recrutamento de neutrófilos circulantes por endotélio inflamado. Uma grande vantagem destes modelos é a capacidade de analisar cada passo na cascata de adesão de leucócitos no fim, como poderia ocorrer in vivo. Nós já observado um aumento dependente da dose da adesão de neutrófilos e a transmigração através estimuladas por TNFa CE ^9,29. Descrevemos também como ambos os modelos podem ser adaptados p…

Materials

Collagenase Type Ia	Sigma	C2674	Dilute in 10ml PBS to get a final concentration of 10mg/ml. Store at -20°C in 1ml aliquots.
Dulbecco's PBS	Sigma	D8662	With calcium and magnesium chloride. Keep sterile and store at room temperature.
1X Medium M199	Gibco	31150-022	Warm in 37 °C water bath before use.
Gentamicin sulphate	Sigma	G1397	Store at 4°C. Add to M199 500ml bottle.
Human epidermal growth factor	Sigma	E9644	Store at -20°C in 10µl aliquots.
Fetal calf serum (FCS)	Sigma	F9665	FCS must be batch tested to ensure the growth and viability of isolated EC. Heat inactivate at 56°C. Store in 10ml aliquots at -20°C.
Amphotericin B	Gibco	15290-026	Potent and becomes toxic within a week so fresh complete HUVEC medium must be made up every week. Store at -20°C in 1ml aliquots.
Hydrocortisone	Sigma	H0135	Stock is in ethanol. Store at -20°C in 10µl aliquots.
Collagenase Type II	Sigma	C6885	Dilute stock in PBS to a final concentration of 100mg/ml. Store at -20°C in 100µl aliquots.
Hyaluronidase	Sigma	H3631	Dilute stock in PBS to a final concentration of 20,000U/ml. Store at -20°C in 100µl aliquots.
100µm cell strainer for 50ml centifuge tube	Scientific Lab Supplies (SLS)	352360	Other commercially available cell strainers (e.g. Greiner bio-one) can also be used.
DMEM low glucose	Biosera	LM-D1102/500	Warm in 37 °C water bath before use.
Penicillin/Streptomycin mix	Sigma	P4333	Store at -20°C in 1ml aliquots.
25cm2 tissue culture flask	SLS	353109
75cm2 tissue culture flask	SLS	353136
Bone marrow mesenchymal stem cells vial	Lonza	PT-2501	Store in liquid nitrogen upon arrival. Cells are at passage 2 upon arrival but are designated passage 0. Exapand to passage 3 and store in liquid nitrogen for later use.
Mesenchymal stem cell growth medium (MSCGM)	Lonza	PT-3001	Warm in 37 °C water bath before use. For Cell Tracker Green staining use medium without FCS.
EDTA (0.02%) solution	Sigma	E8008	Store at 4°C. Warm in 37°C water bath before use.
Trypsin solution	Sigma	T4424	Store at -20°C in 2ml aliquots. Thaw at room temperature and use immediately.
Cryovials	Greiner bio-one	2019-02	Keep on ice before adding before adding cell suspension.
Mr. Frosty Freezing Container	Nalgene	5100-0001	Store at room temperature. When adding cryovials with cells store at -80°C for 24h before transfrring cells to liquid nitrogen.
Ibidi u-Slide VI (0.4), T/C treated, sterile	Ibidi	IB-80606	Alternative models include glass capillaries, Cellix Biochips (www.cellixltd.com), BioFlux Plates (www.fluxionbio.com/bioflux/) and GlycoTech parallel plate flow chambers (http://www.glycotech.com/apparatus/parallel.html).
Cell tracker green dye	Life technologies	C2925	Store in 5µl aliquots at -20°C. Dilute in 5ml prewarmed (at 37°C) MSCGM.
Cell counting chambers	Nexcelom	SD-100	Alternatively a haemocytometer can be used.
Cellometer auto T4 cell counter	Nexcelom	Auto T4-203-0238
Tumor necrosis factor α (TNFα)	R&D Systems	210-TA-100	Dilute stock in PBS to a final concentration of 100,000U/ml. Store at -80°C in 10µl aliquots.
6-well, 0.4µm PET Transwell filters	SLS	353090
K2-EDTA in 10ml tubes	Sarstedt		Store at room temperature.
Histopaque 1119	Sigma	11191	Store at 4°C. Warm to room temperature before use.
Histopaque 1077	Sigma	10771	Store at 4°C. Warm to room temperature before use.
10ml round bottomed tube	Appleton Woods	SC211 142 AS
7.5% BSA Fraction V solution	Life technologies	15260-037	Store at 4°C.
20ml Plastipak syringes	BD falcon	300613
5ml Plastipak syringes	BD falcon	302187
2ml Plastipak syringes	BD falcon	300185
3M hypo-allergenic surgical tape 9m x 2.5cm	Micropore	1530-1	Use to secure the syringe tap onto the wall of the perspex chamber.
Silicon rubber tubing, internal diameter/external diameter (ID/OD) of 1/3mm (thin tubing)	Fisher Scientific	FB68854	Cut silicon tubing to the appropriate size. All tubing leading directly to the electronic microvalve must be thin.
Silicon rubber tubing ID/OD of 2/4mm (thick tubing)	Fisher Scientific	FB68855
Portex Blue Line Manometer tubing	Smiths	200/495/200	Tubing leading to the syringe pump.
3-way stopcock	BOC Ohmeda AB
Glass 50ml syringe for pump	Popper Micromate	550962	Must be primed prior to use by removing any air bubbles.
Glass coverslip	Raymond A Lamb		26x76mm coverslips made to order. Lot number 2440980.
Parafilm gasket	American National Can Company		Cut a 26x76mm piece of parafilm using an aluminium template and cut a 20x4mm slot into it using a scalpel 10a. Gasket thickness is approximately 133µm.
Two perspex parallel plates	Wolfson Applied Technology Laboratory		Specially designed chamber consisting of parallel plates held together by 8 screws. The lower plate has a viewing slot cut out in the middle and a shallow recess milled to allow space for the coverslip, filter and gasket. The upper perspex plate has an inlet and outlet hole positioned over the flow channel.
Electronic 3-way microvalve with min. dead space	Lee Products Ltd.	LFYA1226032H	Electronically connected to a 12 volt DC power supply.
Syringe pump for infusion/withdrawal (PHD2000)	Harvard Apparatus	70-2001	Set the diameter to 29mm and refill (flow) rate.
L-shaped connector	Labhut	LE876	To attach to the inlet and outlet ports onto the Ibidi microslide channel.
Video camera	Qimaging	01-QIC-F-M-12-C	Connected to a computer which enables digitall videos to be recorded.
Image-Pro Plus 7.0	Media Cybernetics	41N70000-61592	For data analysis. Manually tag cells displaying the different behaviors. Track cells for analysis of rolling and migration velocities.
			Refer to product datasheets for details on hazards of using the reagents described here.