フローから白血球の補充に間質細胞の影響を分析する

Summary

流れから白血球を募集する炎症を起こした内皮の能力は、間葉系間質細胞によって調節されている。我々は、フローからの好中球動員を評価し、間葉系間質細胞は、このプロセスの調節に果たす役割を調べるために使用することができる一次ヒト細胞を組み込んだ2 のインビトロモデルを記述する。

Abstract

間質細胞は、隣接する内皮細胞とのクロストークを通じて炎症の間に循環白血球の動員を調節する。ここでは、炎症を起こした内皮細胞によって流れから循環好中球の動員を研究するための2 のin vitro「血管」のモデルについて説明します。これらのモデルの主な利点は、 生体内で起こるように、順番に白血球接着カスケードの各ステップを分析する能力である。また、両方のモデルは、白血球動員を調節する際に、この場合、間葉系幹細胞（MSC）は、間質細胞の役割を研究するために適合させることができる方法を記載している。

初代内皮細胞は、Ibidiマイクロスライド上または24時間トランスウェルフィルターの両側に直接接触したヒトMSCを単独で、または一緒に培養した。培養物を、4時間、腫瘍壊死因子α（TNFα）で刺激し、フローベースの接着アッセイに組み入れた。好中球のボーラスを灌流した4分間の内皮上。好中球と内皮との相互作用を流れるの捕獲は位相差顕微鏡により可視化した。

両方のモデルでは、サイトカイン刺激は、用量依存的に流れる好中球の内皮細胞の動員を増加させた。動員された好中球の挙動の分析は、ローリングの用量依存的減少および内皮を通じて遊走の用量依存的増加を示した。共培養では、MSCは、TNFαで刺激された内皮への好中球の接着を抑制した。

当社のフローベースの接着モデルが循環から白血球動員の初期段階を模倣する。白血球に加えて、彼らはそのような治療的に投与MSCまたは循環腫瘍細胞のような他の細胞型の動員を調べるために使用することができる。我々の多層共培養モデルは、MSCが炎症性サイトカインに対する応答を変更するために内皮と通信することが示されている、alteri好中球の動員をngの。このようなモデルを用いてさらに研究が完全に炎症中の白血球の動員をどのように影響するか、間質の異なる組織や条件から細胞（炎症性疾患または癌）を理解するために必要とされている。

Introduction

炎症は、微生物感染または白血球に入ると解像度^1,2を可能にするために炎症を起こした組織からの出口の厳しい規制を必要とする組織損傷に対する防御応答である。内皮細胞（EC）、その行血管、循環白血球および組織常駐間質細胞の間のクロストークは、このプロセス^3を調整^するために不可欠である。しかし、白血球およびそれらの無効なクリアランスの制御されない動員は、慢性炎症性疾患⁴の発展を支える。健康および疾患における白血球動員の我々の現在の理解は不完全であり、より堅牢なモデルは、このプロセスを分析するために必要とされる。

後毛細血管細静脈の血管ECを通して血液から白血球の動員を支援するメカニズムはよく^1,2,5に記載されている。循環白血球は、特殊な受容体（ 例えば、VCAM-1、E-セレクチン、P-セレクチン）によって捕捉される炎症性内皮上にアップレギュレートされている。これらの一時的な相互作用は、白血球が表面に結合したケモカインおよび白血球^{、6- 11}で表さインテグリンを活性化する脂質由来メディエーター（起源の内皮または間質のいずれか）と対話することを可能にする。これは、次に接着性を安定化し、内皮を横断し、組織^12〜15への移行を駆動する。組織内では、白血球がそれらの運動性、機能および生存^16,17に影響^を与える間質由来物質にさらされている募集。成長している証拠は、信号は、次のために募集プロセス条件白血球の各段階で受信したことを示唆している。しかし、白血球動員の我々の理解は不完全のままと非常に少ないが、組織内のコンポーネント整形白血球の動きについて知られている。

バーミンガムでは、からの白血球の動員を研究するためのin vitroでのいくつかの「血管」モデルを開発してきました流れ^9,18,19。私たちは現在、白血球動員の血管のEC行為として即時の規制当局は、地元の微小環境の変化に対応していることを理解しています。具体的には、組織常駐間質細胞が活発に動員³におけるそれらの役割に影響を与えるために、隣接する血管ECと会話によって部分的に、炎症反応を調節することができる。我々は以前、様々な間質細胞は、組織特異的に接着および白血球の移動をサポートするECの能力を調節することが示されており、これらの効果は、慢性疾患^13,16,20,21における変化したことになる。このように、間質細胞を各炎症反応²²のコンテキストを定義する組織「アドレスコード」を確立する。より最近では、我々は、骨髄由来MSC（BMMSC）は強力両方の好中球の動員の低下につながる、サイトカインに対するECの応答をダウンレギュレートし^{、23リンパ}球ことを実証した。

メカニズムGOVerning募集が明らかにin vitroでは、主に分離して単一の細胞型（ 例えば、EC）またはタンパク質を組み込んだアッセイを使用している。しかし、これらの研究を考慮に入れていない局所組織環境の影響（ すなわち、間質細胞の存在）の白血球の動員に関する組織へのそれらのその後の移行。ここでは、間質細胞は、特に間葉幹細胞た二フローベースの方法（MSC）を表すEC ²³と共培養する。このようなモデルは、流れから白血球動員をサポートするために、特に能力、我々は、内皮応答に対する間質細胞の効果を調べることを可能にする。

Protocol

初代ヒト内皮細胞と間葉系幹細胞の単離および培養ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）の単離および培養： ペーパータオルでトレイにへその緒を入れて、70％エタノールでスプレー。組織培養フードに置きます。両端の静脈とカニューレを挿入を識別します。それを確保するためにカニューレを挿入端部の周りにケーブルタイを配置します。 PBSを注射器を使用して静脈血を洗…

Representative Results

当初、我々はIbidiのマイクロスライドモデル（ – 9第7節 ） を使用して、フローからの好中球の募集にTNFαでECを刺激する効果を分析した。 TNFα、任意の好中球は、内皮単層に付着した小さな場合（ 図2A）の非存在下で。これは、25,26を結合サポートするために必要な接着分子（セレクチン）またはケモカインを発現しないEC休止/未処理として、期?…

Discussion

ここでは、炎症を起こした内皮によって循環好中球の動員を研究するための2 のin vitro「血管」のモデルについて説明します。これらのモデルの主な利点は、 生体内で起こるように、順番に白血球接着カスケードの各ステップを分析する能力である。我々は以前、TNFαで刺激されたEC ^9,29を通じて用量依存的に好中球の接着の増加と転生を観察している。また、両モデルは…

Materials

Collagenase Type Ia	Sigma	C2674	Dilute in 10ml PBS to get a final concentration of 10mg/ml. Store at -20°C in 1ml aliquots.
Dulbecco's PBS	Sigma	D8662	With calcium and magnesium chloride. Keep sterile and store at room temperature.
1X Medium M199	Gibco	31150-022	Warm in 37 °C water bath before use.
Gentamicin sulphate	Sigma	G1397	Store at 4°C. Add to M199 500ml bottle.
Human epidermal growth factor	Sigma	E9644	Store at -20°C in 10µl aliquots.
Fetal calf serum (FCS)	Sigma	F9665	FCS must be batch tested to ensure the growth and viability of isolated EC. Heat inactivate at 56°C. Store in 10ml aliquots at -20°C.
Amphotericin B	Gibco	15290-026	Potent and becomes toxic within a week so fresh complete HUVEC medium must be made up every week. Store at -20°C in 1ml aliquots.
Hydrocortisone	Sigma	H0135	Stock is in ethanol. Store at -20°C in 10µl aliquots.
Collagenase Type II	Sigma	C6885	Dilute stock in PBS to a final concentration of 100mg/ml. Store at -20°C in 100µl aliquots.
Hyaluronidase	Sigma	H3631	Dilute stock in PBS to a final concentration of 20,000U/ml. Store at -20°C in 100µl aliquots.
100µm cell strainer for 50ml centifuge tube	Scientific Lab Supplies (SLS)	352360	Other commercially available cell strainers (e.g. Greiner bio-one) can also be used.
DMEM low glucose	Biosera	LM-D1102/500	Warm in 37 °C water bath before use.
Penicillin/Streptomycin mix	Sigma	P4333	Store at -20°C in 1ml aliquots.
25cm2 tissue culture flask	SLS	353109
75cm2 tissue culture flask	SLS	353136
Bone marrow mesenchymal stem cells vial	Lonza	PT-2501	Store in liquid nitrogen upon arrival. Cells are at passage 2 upon arrival but are designated passage 0. Exapand to passage 3 and store in liquid nitrogen for later use.
Mesenchymal stem cell growth medium (MSCGM)	Lonza	PT-3001	Warm in 37 °C water bath before use. For Cell Tracker Green staining use medium without FCS.
EDTA (0.02%) solution	Sigma	E8008	Store at 4°C. Warm in 37°C water bath before use.
Trypsin solution	Sigma	T4424	Store at -20°C in 2ml aliquots. Thaw at room temperature and use immediately.
Cryovials	Greiner bio-one	2019-02	Keep on ice before adding before adding cell suspension.
Mr. Frosty Freezing Container	Nalgene	5100-0001	Store at room temperature. When adding cryovials with cells store at -80°C for 24h before transfrring cells to liquid nitrogen.
Ibidi u-Slide VI (0.4), T/C treated, sterile	Ibidi	IB-80606	Alternative models include glass capillaries, Cellix Biochips (www.cellixltd.com), BioFlux Plates (www.fluxionbio.com/bioflux/) and GlycoTech parallel plate flow chambers (http://www.glycotech.com/apparatus/parallel.html).
Cell tracker green dye	Life technologies	C2925	Store in 5µl aliquots at -20°C. Dilute in 5ml prewarmed (at 37°C) MSCGM.
Cell counting chambers	Nexcelom	SD-100	Alternatively a haemocytometer can be used.
Cellometer auto T4 cell counter	Nexcelom	Auto T4-203-0238
Tumor necrosis factor α (TNFα)	R&D Systems	210-TA-100	Dilute stock in PBS to a final concentration of 100,000U/ml. Store at -80°C in 10µl aliquots.
6-well, 0.4µm PET Transwell filters	SLS	353090
K2-EDTA in 10ml tubes	Sarstedt		Store at room temperature.
Histopaque 1119	Sigma	11191	Store at 4°C. Warm to room temperature before use.
Histopaque 1077	Sigma	10771	Store at 4°C. Warm to room temperature before use.
10ml round bottomed tube	Appleton Woods	SC211 142 AS
7.5% BSA Fraction V solution	Life technologies	15260-037	Store at 4°C.
20ml Plastipak syringes	BD falcon	300613
5ml Plastipak syringes	BD falcon	302187
2ml Plastipak syringes	BD falcon	300185
3M hypo-allergenic surgical tape 9m x 2.5cm	Micropore	1530-1	Use to secure the syringe tap onto the wall of the perspex chamber.
Silicon rubber tubing, internal diameter/external diameter (ID/OD) of 1/3mm (thin tubing)	Fisher Scientific	FB68854	Cut silicon tubing to the appropriate size. All tubing leading directly to the electronic microvalve must be thin.
Silicon rubber tubing ID/OD of 2/4mm (thick tubing)	Fisher Scientific	FB68855
Portex Blue Line Manometer tubing	Smiths	200/495/200	Tubing leading to the syringe pump.
3-way stopcock	BOC Ohmeda AB
Glass 50ml syringe for pump	Popper Micromate	550962	Must be primed prior to use by removing any air bubbles.
Glass coverslip	Raymond A Lamb		26x76mm coverslips made to order. Lot number 2440980.
Parafilm gasket	American National Can Company		Cut a 26x76mm piece of parafilm using an aluminium template and cut a 20x4mm slot into it using a scalpel 10a. Gasket thickness is approximately 133µm.
Two perspex parallel plates	Wolfson Applied Technology Laboratory		Specially designed chamber consisting of parallel plates held together by 8 screws. The lower plate has a viewing slot cut out in the middle and a shallow recess milled to allow space for the coverslip, filter and gasket. The upper perspex plate has an inlet and outlet hole positioned over the flow channel.
Electronic 3-way microvalve with min. dead space	Lee Products Ltd.	LFYA1226032H	Electronically connected to a 12 volt DC power supply.
Syringe pump for infusion/withdrawal (PHD2000)	Harvard Apparatus	70-2001	Set the diameter to 29mm and refill (flow) rate.
L-shaped connector	Labhut	LE876	To attach to the inlet and outlet ports onto the Ibidi microslide channel.
Video camera	Qimaging	01-QIC-F-M-12-C	Connected to a computer which enables digitall videos to be recorded.
Image-Pro Plus 7.0	Media Cybernetics	41N70000-61592	For data analysis. Manually tag cells displaying the different behaviors. Track cells for analysis of rolling and migration velocities.
			Refer to product datasheets for details on hazards of using the reagents described here.