تحليل آثار خلايا انسجة على تجنيد الكريات البيض من التدفق
Summary
وينظم قدرة البطانة الملتهبة لتجنيد الكريات البيض من تدفق الخلايا اللحمية الوسيطة. وصفنا اثنين في المختبر نماذج دمج خلايا الإنسان الأساسية التي يمكن استخدامها لتقييم التوظيف العدلات من التدفق ودراسة الدور الذي تلعبه خلايا انسجة الوسيطة في تنظيم هذه العملية.
Abstract
خلايا انسجة تنظم توظيف تعميم الكريات البيض خلال الالتهاب من خلال عبر الحديث مع الخلايا البطانية المجاورة. نحن هنا وصف اثنين في المختبر "الأوعية الدموية" نماذج لدراسة توظيف تعميم العدلات من تدفق الخلايا البطانية الملتهبة. والميزة الرئيسية لهذه النماذج هي القدرة على تحليل كل خطوة في سلسلة التصاق الكريات البيض في النظام، كما أن تحدث في الجسم الحي. وصفنا أيضا كيف يمكن تكييفها كلا النموذجين لدراسة دور الخلايا اللحمية، في هذه الحالة الخلايا الجذعية الوسيطة (MSC)، في تنظيم تجنيد الكريات البيض.
كان المثقف الخلايا البطانية الأولية وحدها أو مع MSC الإنسان في اتصال مباشر على microslides Ibidi أو على طرفي نقيض من مرشح Transwell لمدة 24 ساعة. وقد حفزت الثقافات مع عامل نخر الورم ألفا (TNFα) لمدة 4 ساعة ودمجها في التصاق الفحص القائمة على التدفق. تم perfused لبلعة العدلاتعلى البطانة لمدة 4 دقائق. وقد تصور القبض على تدفق العدلات وتفاعلاتها مع البطانة التي على النقيض من المرحلة المجهري.
في كلا النموذجين، وزيادة خلوى التحفيز التوظيف البطانية العدلات تتدفق بطريقة تعتمد على الجرعة. وأظهر تحليل سلوك العدلات جند انخفاضا تعتمد على الجرعة في المتداول وزيادة تعتمد على الجرعة في التهجير من خلال البطانة. في ثقافة مشتركة، قمعت MSC العدلات التصاق لحفز TNFα البطانة.
لدينا نماذج المستندة إلى التصاق تدفق تحاكي المراحل الأولية لتجنيد الكريات البيض من التداول. بالإضافة إلى الكريات البيض، ويمكن استخدامها لدراسة توظيف أنواع الخلايا الأخرى، مثل MSC أو تعميم الخلايا السرطانية تدار علاجيا. وقد أظهرت لنا نماذج متعددة الطبقات المشارك الثقافة التي MSC التواصل مع البطانة لتعديل استجابتها لالسيتوكينات الموالية للالتهابات، alteriنانوغرام تجنيد العدلات. مزيد من الابحاث التي تستخدم مثل هذه النماذج هو مطلوب لنفهم تماما كيف الخلايا اللحمية من الأنسجة المختلفة والشروط (الاضطرابات الالتهابية أو السرطان) التأثير على تجنيد الكريات البيض خلال الالتهاب.
Introduction
الالتهاب هو استجابة وقائية لالعدوى الميكروبية أو إصابة الأنسجة التي تتطلب تنظيم محكم من دخول الكريات البيض في والخروج من الأنسجة الملتهبة للسماح قرار 1،2. عبر الحديث بين الخلايا البطانية (EC) أن السفن خط الدم، الكريات البيض وتعميم خلايا انسجة الأنسجة المقيمين ضروري لتنسيق هذه العملية 3. ومع ذلك، والتوظيف غير المنضبط من الكريات البيض وإزالتها غير فعالة ركيزة تطور الأمراض الالتهابية المزمنة 4. فهمنا الحالي للتجنيد الكريات البيض في الصحة والمرض غير مكتمل وهناك حاجة إلى نماذج أكثر قوة لتحليل هذه العملية.
آليات دعم التوظيف من الكريات البيض من الدم من خلال الأوعية الدموية EC في الأوردة ما بعد الشعرية وقد وصفت جيدا 1،2،5. يتم التقاط الكريات البيض الدموية من خلال مستقبلات متخصصة (على سبيل المثال، VCAM-1، E-selectin، ف selectin) الذيوتصل ينظم على البطانة الملتهبة. هذه التفاعلات عابرة تسمح الكريات البيض للتفاعل مع سطح ملزمة كيموكينات وسطاء المشتقة من الدهون (إما البطانية أو اللحمية في الأصل) التي تنشط integrins التي أعربت عنها الكريات البيض 6- 11. وهذا بدوره استقرار التصاق ومحركات الهجرة عبر البطانة وإلى الأنسجة 12- 15. داخل الأنسجة، وتجنيد يتعرضون الكريات البيض إلى وكلاء المشتقة من انسجة التي تؤثر على الحركة والوظيفة والبقاء على قيد الحياة 16،17. أدلة متزايدة تشير بقوة إلى أن إشارات وردت في كل مرحلة من شروط عملية التوظيف الكريات البيض لالمقبل. ومع ذلك، فإن فهمنا للتجنيد الكريات البيض لا يزال غير مكتمل، والقليل جدا هو معروف عن حركة الكريات البيض مكونات تشكيل داخل الأنسجة.
في برمنغهام وضعنا عدة في المختبر "الأوعية الدموية" نماذج لدراسة تجنيد الكريات البيض منتدفق 9،18،19. ونحن نفهم الآن أن الأوعية الدموية فعل EC المنظمين المباشرة اعتبارا من تجنيد الكريات البيض الاستجابة للتغيرات في المكروية المحلية. على وجه التحديد، يمكن للخلايا انسجة الأنسجة مقيمة تنظيم بنشاط الاستجابة الالتهابية، في جزء منه عن طريق التحدث مع الأوعية الدموية EC المجاورة للتأثير على دورها في تجنيد 3. لقد أظهرنا سابقا أن الخلايا اللحمية مختلف تعدل قدرة EC لدعم التصاق وهجرة الكريات البيض بطريقة الأنسجة محددة، وأن هذه الآثار أصبحت تغير في الأمراض المزمنة 13،16،20،21. وهكذا، والخلايا اللحمية تضع الأنسجة "عنوان رموز" التي تحدد سياق كل استجابة التهابية 22. وفي الآونة الأخيرة، لقد أثبتنا أن النخاع العظمي المستمدة MSC (BMMSC) أكثر قدرة أسفل تنظيم استجابة EC لالسيتوكينات، مما يؤدي إلى انخفاض في توظيف كل من العدلات واللمفاويات 23.
آليات الموقع govتوضيح erning التوظيف في المختبر وتستخدم إلى حد كبير المقايسات تتضمن نوع واحد خلية (على سبيل المثال، EC) أو البروتين في عزلة. ومع ذلك، فإن هذه الدراسات لا تأخذ في الاعتبار آثار البيئة الأنسجة المحلية (أي وجود خلايا انسجة) على تجنيد الكريات البيض وهجرتهم اللاحقة في الأنسجة. نحن هنا وصف طريقتين القائم على التدفق في الخلايا التي اللحمية، وتحديدا الوسيطة تنبع الخلايا (MSC)، هي شارك في تربيتها مع EC 23. مثل هذه النماذج تسمح لنا لدراسة تأثير الخلايا اللحمية على الاستجابات البطانية، ولا سيما قدرتها على دعم التوظيف الكريات البيض من التدفق.
Protocol
Representative Results
Discussion
نحن هنا وصف اثنين في المختبر "الأوعية الدموية" نماذج لدراسة توظيف تعميم العدلات من قبل البطانة الملتهبة. والميزة الرئيسية لهذه النماذج هي القدرة على تحليل كل خطوة في سلسلة التصاق الكريات البيض في النظام، كما أن تحدث في الجسم الحي. وقد لاحظنا سابقا زياد…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Umbilical cords were collected with the assistance of the Birmingham Women’s Health Care NHS Trust. HMM was supported by an Arthritis Research UK Career Development Fellowship (19899) and Systems Science for Health, University of Birmingham (5212).
Materials
| Collagenase Type Ia | Sigma | C2674 | Dilute in 10ml PBS to get a final concentration of 10mg/ml. Store at -20°C in 1ml aliquots. |
| Dulbecco's PBS | Sigma | D8662 | With calcium and magnesium chloride. Keep sterile and store at room temperature. |
| 1X Medium M199 | Gibco | 31150-022 | Warm in 37 °C water bath before use. |
| Gentamicin sulphate | Sigma | G1397 | Store at 4°C. Add to M199 500ml bottle. |
| Human epidermal growth factor | Sigma | E9644 | Store at -20°C in 10µl aliquots. |
| Fetal calf serum (FCS) | Sigma | F9665 | FCS must be batch tested to ensure the growth and viability of isolated EC. Heat inactivate at 56°C. Store in 10ml aliquots at -20°C. |
| Amphotericin B | Gibco | 15290-026 | Potent and becomes toxic within a week so fresh complete HUVEC medium must be made up every week. Store at -20°C in 1ml aliquots. |
| Hydrocortisone | Sigma | H0135 | Stock is in ethanol. Store at -20°C in 10µl aliquots. |
| Collagenase Type II | Sigma | C6885 | Dilute stock in PBS to a final concentration of 100mg/ml. Store at -20°C in 100µl aliquots. |
| Hyaluronidase | Sigma | H3631 | Dilute stock in PBS to a final concentration of 20,000U/ml. Store at -20°C in 100µl aliquots. |
| 100µm cell strainer for 50ml centifuge tube | Scientific Lab Supplies (SLS) | 352360 | Other commercially available cell strainers (e.g. Greiner bio-one) can also be used. |
| DMEM low glucose | Biosera | LM-D1102/500 | Warm in 37 °C water bath before use. |
| Penicillin/Streptomycin mix | Sigma | P4333 | Store at -20°C in 1ml aliquots. |
| 25cm2 tissue culture flask | SLS | 353109 | |
| 75cm2 tissue culture flask | SLS | 353136 | |
| Bone marrow mesenchymal stem cells vial | Lonza | PT-2501 | Store in liquid nitrogen upon arrival. Cells are at passage 2 upon arrival but are designated passage 0. Exapand to passage 3 and store in liquid nitrogen for later use. |
| Mesenchymal stem cell growth medium (MSCGM) | Lonza | PT-3001 | Warm in 37 °C water bath before use. For Cell Tracker Green staining use medium without FCS. |
| EDTA (0.02%) solution | Sigma | E8008 | Store at 4°C. Warm in 37°C water bath before use. |
| Trypsin solution | Sigma | T4424 | Store at -20°C in 2ml aliquots. Thaw at room temperature and use immediately. |
| Cryovials | Greiner bio-one | 2019-02 | Keep on ice before adding before adding cell suspension. |
| Mr. Frosty Freezing Container | Nalgene | 5100-0001 | Store at room temperature. When adding cryovials with cells store at -80°C for 24h before transfrring cells to liquid nitrogen. |
| Ibidi u-Slide VI (0.4), T/C treated, sterile | Ibidi | IB-80606 | Alternative models include glass capillaries, Cellix Biochips (www.cellixltd.com), BioFlux Plates (www.fluxionbio.com/bioflux/) and GlycoTech parallel plate flow chambers (http://www.glycotech.com/apparatus/parallel.html). |
| Cell tracker green dye | Life technologies | C2925 | Store in 5µl aliquots at -20°C. Dilute in 5ml prewarmed (at 37°C) MSCGM. |
| Cell counting chambers | Nexcelom | SD-100 | Alternatively a haemocytometer can be used. |
| Cellometer auto T4 cell counter | Nexcelom | Auto T4-203-0238 | |
| Tumor necrosis factor α (TNFα) | R&D Systems | 210-TA-100 | Dilute stock in PBS to a final concentration of 100,000U/ml. Store at -80°C in 10µl aliquots. |
| 6-well, 0.4µm PET Transwell filters | SLS | 353090 | |
| K2-EDTA in 10ml tubes | Sarstedt | Store at room temperature. | |
| Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | Store at 4°C. Warm to room temperature before use. |
| Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | Store at 4°C. Warm to room temperature before use. |
| 10ml round bottomed tube | Appleton Woods | SC211 142 AS | |
| 7.5% BSA Fraction V solution | Life technologies | 15260-037 | Store at 4°C. |
| 20ml Plastipak syringes | BD falcon | 300613 | |
| 5ml Plastipak syringes | BD falcon | 302187 | |
| 2ml Plastipak syringes | BD falcon | 300185 | |
| 3M hypo-allergenic surgical tape 9m x 2.5cm | Micropore | 1530-1 | Use to secure the syringe tap onto the wall of the perspex chamber. |
| Silicon rubber tubing, internal diameter/external diameter (ID/OD) of 1/3mm (thin tubing) | Fisher Scientific | FB68854 | Cut silicon tubing to the appropriate size. All tubing leading directly to the electronic microvalve must be thin. |
| Silicon rubber tubing ID/OD of 2/4mm (thick tubing) | Fisher Scientific | FB68855 | |
| Portex Blue Line Manometer tubing | Smiths | 200/495/200 | Tubing leading to the syringe pump. |
| 3-way stopcock | BOC Ohmeda AB | ||
| Glass 50ml syringe for pump | Popper Micromate | 550962 | Must be primed prior to use by removing any air bubbles. |
| Glass coverslip | Raymond A Lamb | 26x76mm coverslips made to order. Lot number 2440980. | |
| Parafilm gasket | American National Can Company | Cut a 26x76mm piece of parafilm using an aluminium template and cut a 20x4mm slot into it using a scalpel 10a. Gasket thickness is approximately 133µm. | |
| Two perspex parallel plates | Wolfson Applied Technology Laboratory | Specially designed chamber consisting of parallel plates held together by 8 screws. The lower plate has a viewing slot cut out in the middle and a shallow recess milled to allow space for the coverslip, filter and gasket. The upper perspex plate has an inlet and outlet hole positioned over the flow channel. | |
| Electronic 3-way microvalve with min. dead space | Lee Products Ltd. | LFYA1226032H | Electronically connected to a 12 volt DC power supply. |
| Syringe pump for infusion/withdrawal (PHD2000) | Harvard Apparatus | 70-2001 | Set the diameter to 29mm and refill (flow) rate. |
| L-shaped connector | Labhut | LE876 | To attach to the inlet and outlet ports onto the Ibidi microslide channel. |
| Video camera | Qimaging | 01-QIC-F-M-12-C | Connected to a computer which enables digitall videos to be recorded. |
| Image-Pro Plus 7.0 | Media Cybernetics | 41N70000-61592 | For data analysis. Manually tag cells displaying the different behaviors. Track cells for analysis of rolling and migration velocities. |
| Refer to product datasheets for details on hazards of using the reagents described here. |
References
- Springer, T. A. Traffic signals on endothelium for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration. Ann. Rev. Physiol. 57, 827-872 (1995).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
- McGettrick, H. M., Butler, L. M., Buckley, C. D., Rainger, G. E., Nash, G. B. Tissue stroma as a regulator of leukocyte recruitment in inflammation. Journal of leukocyte biology. 91 (3), 385-400 (2012).
- Serhan, C. N., Savill, J. Resolution of inflammation: the beginning programs the end. Nature immunology. 6 (12), 1191-1197 (2005).
- Schmidt, S., Moser, M., Sperandio, M. The molecular basis of leukocyte recruitment and its deficiencies. Molecular immunology. 55, 49-58 (2013).
- Luu, N. T., Rainger, G. E., Nash, G. B. Differential Ability of Exogenous Chemotactic Agents to Disrupt Transendothelial Migration of Flowing Neutrophils. The Journal of Immunology. 164 (11), 5961-5969 (2000).
- Smith, C. W., Rothlein, R., et al. Recognition of an endothelial determinant for CD 18-dependent human neutrophil adherence and transendothelial migration. The Journal of clinical investigation. 82 (5), 1745-1756 (1988).
- Luscinskas, F. W., Brock, A. F., Arnaout, M. A., Gimbrone, M. A. Endothelial-leukocyte adhesion molecule-1-dependent and leukocyte (CD11/CD18)-dependent mechanisms contribute to polymorphonuclear leukocyte adhesion to cytokine-activated human vascular endothelium. J. Immunol. 142 (7), (1989).
- Bahra, P., Rainger, G. E., Wautier, J. L., Nguyet-Thin, L., Nash, G. B. Each step during transendothelial migration of flowing neutrophils is regulated by the stimulatory concentration of tumour necrosis factor-alpha. Cell adhesion and communication. 6 (6), 491-501 (1998).
- Piali, L., Weber, C., et al. The chemokine receptor CXCR3 mediates rapid and shear-resistant adhesion-induction of effector T lymphocytes by the chemokines IP10 and Mig. European journal of immunology. 28 (3), 961-972 (1998).
- McGettrick, H. M., Smith, E., et al. Fibroblasts from different sites may promote or inhibit recruitment of flowing lymphocytes by endothelial cells. European journal of immunology. 39 (1), 113-125 (2009).
- McGettrick, H. M., Hunter, K., Moss, P. a., Buckley, C. D., Rainger, G. E., Nash, G. B. Direct observations of the kinetics of migrating T cells suggest active retention by endothelial cells with continual bidirectional migration. Journal of leukocyte biology. 85 (1), 98-107 (2009).
- McGettrick, H. M., Buckley, C. D., Filer, A., Rainger, G. E., Nash, G. B. Stromal cells differentially regulate neutrophil and lymphocyte recruitment through the endothelium. Immunology. 131 (3), 357-370 (2010).
- Tull, S. P., Yates, C. M., et al. Omega-3 Fatty acids and inflammation: novel interactions reveal a new step in neutrophil recruitment. PLoS biology. 7 (8), e1000177 (2009).
- Ahmed, S. R., McGettrick, H. M. Prostaglandin D2 regulates CD4+ memory T cell trafficking across blood vascular endothelium and primes these cells for clearance across lymphatic endothelium. Journal of immunology. 187 (3), 1432-1439 (2011).
- Bradfield, P. F., Amft, N., et al. Rheumatoid fibroblast-like synoviocytes overexpress the chemokine stromal cell-derived factor 1 (CXCL12), which supports distinct patterns and rates of CD4+ and CD8+ T cell migration within synovial tissue. Arthritis and rheumatism. 48 (9), 2472-2482 (2003).
- Filer, A., Parsonage, G., et al. Differential survival of leukocyte subsets mediated by synovial, bone marrow, and skin fibroblasts: site-specific versus activation-dependent survival of T cells and neutrophils. Arthritis and rheumatism. 54 (7), 2096-2108 (2006).
- Lally, F., Smith, E., et al. A novel mechanism of neutrophil recruitment in a coculture model of the rheumatoid synovium. Arthritis and rheumatism. 52 (11), 3460-3490 (2005).
- Chakravorty, S. J., McGettrick, H. M., Butler, L. M., Buckley, C. D., Rainger, G. E., Nash, G. B. An in vitro. model for analysing neutrophil migration into and away from the sub-endothelial space: Roles of flow and CD31. Biorheology. 43 (1), 71-82 (2006).
- Rainger, G. E., Nash, G. B. Cellular Pathology of Atherosclerosis Smooth Muscle Cells Prime Cocultured Endothelial Cells for Enhanced Leukocyte Adhesion. Circulation Research. 88 (6), 615-622 (2001).
- Kuravi, S. J., McGettrick, H. M. Podocytes regulate neutrophil recruitment by glomerular endothelial cells via IL-6-mediated crosstalk. Journal of immunology. 193 (1), 234-243 (2004).
- Parsonage, G., Filer, A. D. A stromal address code defined by fibroblasts. Trends in immunology. 26 (3), 150-156 (2005).
- Luu, N. T., McGettrick, H. M. Crosstalk between mesenchymal stem cells and endothelial cells leads to downregulation of cytokine-induced leukocyte recruitment. Stem cells. 31 (12), 2690-2702 (2013).
- Bevilacqua, M. P., Nelson, R. M., Mannori, G., Cecconi, O. Endothelial-leukocyte adhesion molecules in human disease. Annual review of medicine. 45, 361-378 (1994).
- Stanness, K. A., Beatty, P. G., Ochs, H. D., Harlan, J. M. An endothelial cell surface factor(s) induced in vitro. 136 (12), 4548-4553 (1986).
- Burton, V. J., Butler, L. M. Delay of migrating leukocytes by the basement membrane deposited by endothelial cells in long-term culture. Experimental cell research. 317 (3), 276-292 (2011).
- Luu, N. T., Rainger, G. E., Buckley, C. D., Nash, G. B. CD31 Regulates Direction and Rate of Neutrophil Migration over and under Endothelial Cells. Journal of Vascular Research. 40 (5), 467-479 (2003).
- McGettrick, H. M., Buckley, C. D., Ed Rainger, G., Nash, G. B. Influence of stromal cells on lymphocyte adhesion and migration on endothelial cells. Methods in molecular biology. 616, 49-68 (2010).
- Butler, L. M., McGettrick, H. M., Nash, G. B. Static and dynamic assays of cell adhesion relevant to the vasculature. Methods in molecular biology. 467, 211-228 (2009).
- Jeffery, H. C., Buckley, C. D., Moss, P., Rainger, G. E., Nash, G. B., McGettrick, H. M. Analysis of the effects of stromal cells on the migration of lymphocytes into and through inflamed tissue using 3-D culture models. Journal of immunological methods. 400-401, 45-57 (2013).
